UNIVERSITE
CHEIKH ANTA
DIOP de DAKAR
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
*.
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1.
THESE DE DOCTORAT D'ETAT
és SCIENCES NATURELLES
TITRE
'"
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ETUDE DE VOIES D' AMELIORATION GENETIQUE
PAR LA BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION, LES POTENTIALITÉS DE CLONAGE "IN VITRO"
ET LA SYMBIOSE FIXATRICE D'AZOTE CHEZ
ACACIA ALBIDA (DEL.) A. CHEV.
Présentée et soutenue publiquement le
~:~
Janvier 1996
, ..
par
.....
Mme Dia /Gassama Yaye kéne
MAITRE-ASSISTANTE à LA FACULTé DES SCIENCES ET TECHNIQUES
pour obtenir le grade de Docteur ès- Sciences Naturelles
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MEMBRES DU JURY
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Président de jury
Dr Amadou T. BA
Professeur titulaire
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Rapporteur
Dr Mék.into Batcho
Maître de Conférences

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.Rapporteur
Dr Bernard Dreyfus
Directeur de Recherches
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Rapporteur
Dr Emile Duhoux
Professeur titulaire
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Examinateur
Dr Antoine Nongonierma
Professeur titulaire
Exàminateur
Dr Mouhamadou L.Thiam
Professeur titulaire
-.
~
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X"
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.
(

, 1<"
Enseignez la science car celui qui l'enseigne craint
Dieu, celui qui lutte pour elle, livre un combat sacré, celui qui la
possède devient un objet de vénération et de bienveillance.
C'est par la science que le tout-puissant élève les
hommes qu'Il destine à se prononcer sur ce qui est bien.
Il n'ya pas de charité plus méritoire que la propagation
de la science. Celui qui se montre avare d'une science utile, se
verra imposer le jour du jugement dernier un mors de fer.
Quiconque suit la voie pour aller à la science, Dieu lui
facilitera la voie qui mène au Paradis éternel.
t: ~'."/'
......
: .; ,- ~
L'encre des savants vaut mieux que l'encre des
martyrs.
Le Prophète Mohammed (P.S.L)
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..
Cr,
....

Titre: Etude de voies d'amélioration génétique par la biologie de la reproduction,
les potentialités de clonage in vitro et la symbiose fixatrice d'azote chez
Acacia albida (DeL) A. Chev.
NOM Er PRÉNOMS : YAYE KENE GASSAMAIDIA
NATURE DU MÉMOIRE: THÈSE DE DOCTORAT D'É[AT ès SCIENCES NATURELLES DE L'UNIVERSITÉ CHEIKH ANTA
DIOP DE DAKAR
RESUME
L'objectif principal de ce travail est axé sur l'exploration des voies d'amélioration génétique chez Acacia a/bida. Trois axes de
recherche ont été identifiés.
1) En étudiant la biologie de la reproduction. nous nous sommes intéressés à la phénologie et au système de pollinisation.
L'ouverture asynchrone et acropète des fleurs. l'agrégation des monades en une polyade unique. le nombre élevé de polyades émis
au cours d'un évènement pollinatoire. le rapport monade sur ovule (1,5) excédentaire en faveur des grains de pollen. la
possibilité pour un stigmate de recevoir simultanément 2 à 3 polyades. démontrent l'effort fourni par la plante pour assurer une
pollinisation et une fécondation optimales. Grâce aux marqueurs enzymàtiques (estérases), nous avons déterminé l'optimum de
,.. )
réceptivité stigmatique et la durée de viabilité des grains de pollen chez Acacia a/bida. Par des essais de pollinisation controlée,
nous avons réussi à estimer quantitativement le niveau d'auto-incompatibilité; l'index d'auto-incompatibilité (ISI) de 0.25,
indique qu'Acaci~ a/bida et une espèce auto-incompatible bien qu'il existe au niveau individuel une auto-compatibilité partielle.
1ll~'.. 2) La multiplication végétative "in vitro" a été effectuée sur les arbres adultes et a montré que le potentiel morphogène est
.
tributaire de la saison. de la nature du matériel végétal, de l'état de maturité du végétal et de paramètres physiologiques non
/.' encore identifiés. Cependant. l'activité organogène des drageons issus de sujets adultes peut être améliorée par les repiquages
fréquents. à la suite de l'addition de Phloroglucinol (1g/l) dans le milieu de culture. ou aprés un trempage dans une solution
concentrée de BAP (20 mgll) pendant 15 heures. L'optimum d'enracinement obtenu à la suite du traitement au Phloroglucinol, est
de. 50%. La culture d'explants racinaires est une méthode très efficace qui a permis chez Acacia a/bida de regénérer directement à
partir du cortex racinaire des bourgeons adventifs. Nous avons montré que le milieu B5 additionné de BAP et de Spermine lQ-5M
stimule de façon optimale la néoformation des bourgeons.
Il1 3) L'étude de la symbiose fixatrice d'azote atmosphérique a montréque la richesse du substrat en éléments nutritifs constitue un
(
'~'
facteur décisif dans la réponse à l'inoculation; Acacia a/bida est une espèce qui préfère assimiler les éléments nutritifs du sol
t'
1
plutôt que de recourir à la symbiose. Des études menées "in vitro" sur la nutrition minérale azotée. ont montré cependant que la
biomasse et la croissance sont améliorées en présence d'une source d'azote ammoniaquée (5 mM).
Par ailleurs, Acacia a/bida est une espèce nodulée aussi bien par des souches de Bradyrhizobium que par des souches de
, Rhizobium; cependant l'as~ociation avec les souches de Bradyrhizobium est plus efficiente. Les cotylédons grâce à leur forte
teneûr.en azote. jouent un rôle d"'azote starter" en stimulant la croissance et la nodulation. L'infection rhizobienne s'effectue via
les poils absorbants,
i
Mots-clés: Acacia
albida;
phénologie;
pollinisation;
auto-incompatibilité; in
vitro
~l ,micrôpropagationj arbres adultes; racines exciséesj symbiose j Bradyrhizobium; infection.
,,~
' 1 '
.~:' ~~.' .
~i;~ABSTRACT
'!;~tÎ1ëmain objective of this work is based on the investigation of genetical ways to improve Acacia a/bida.Three research areas
'[" h~ve been identified.
. . "1) When studying his reproductive biology. we examined the phenology and pollination, The flowers open asynchronously and
. acropetally; the monads are aggregated to form an unique polyad; during one pollination event, a great number of polyads are
ejected; the ratio monad/ovule (1,5) is in excess for pollen grains, and one stigmate can recieve simultaneouly 2 to 3 polyads.
Ali these factors contribute to the reproductive effort and ensure an optimal poHination. Using biochemical markers
(esterases), we determined the optimal period for stigmate receptivity and the viability period of pollen grains. So we
successfully determined the level of self-incompatibility (0,25) with an individual rate of variability from 0 to 0,50.
2) ln vitro micropropagation has been achieved on mature trees; the results showed that the morphogenetic potential is
,:'ÎJlfluenced by the season. by the origin of the expiant, and by some tree physiological parameters non identified. Nevertheless,
~'~the organogenetic activity of the explants from stump sprouts can be improved with frequent sub-cultures, or after addition of
f' "phloroglucinol (1g11) in the culture medium, or after deeping explants in a solution of BAP (20 mgll) during 15 hours. The
l
,optimal rooting rate (50%) is obtained after the traitement with phloroglucinol. Root excised culture is a more efficient method
\\.. ; il allowed to regenerate directly from cortical tissues numerous adventitious buds. B5 medium with BAP and spermine (10-5 M)
! "< is the best medium to stimulate adventitious budding.
1
1 3) The sudy of nitrogen fixation symbiosis, revealed that soil fertility, is a determinant factor in the response to inoculation.
l'Acacia albida prefers nitrogen assimilation rather than nitrogen fixation. Meanwhile, the study of nitrogen nutrition "in vitro"
of shoots explants of Acacia a/bida, shows that biomass and growlh are improved in the presence of 5mM of Ammonium,
Rhizobium and as weil asBradyrhizobium are infective on roots of A. a/bida and produce nodules. But the association with
Bradyrhizobium is more efficient. The cotyledons which contain a great amount of nitrogen play the role of "nitrogen starter"
and stimulate growth and nodulation. The infection process via root hairs.
Kev-words: Acacia
albida;
phenologyj
poIlination;
self-incompatibility;
in
vitro
micropropagation;
mature
treej
root culture;
symbiosis;
Bradyrhizobium.;
infection.

REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au département de biologie végétale, de la Faculté des Sciences et
Techniques de l'Université Cheikh Anta Diop de Dakar. J'exprime ma profonde
reconnaissance à toutes les personnes qui m'ont permis de mener à bien ce travail.
A Monsieur le Professeur Libasse Diop Doyen de la Faculté des Sciences et
Techniques qui m'a toujours témoigné de son. soutien. Vous m'avez offert, Monsieur le
Doyen, la possibilité de terminer ce travail dans d'excellentes conditions. Je vous
remercie pour votre appui moral et financier.
A.Monsieur le Professeur Amadou Tidjane Ba, vous m'avez montré la voie,
Monsieur le Professeur, en me faisant partager vos remarquables qualités d'enseignant~
j'ai appris avec vous que l'enseignement est un art qu'il faut savoir aimer et partager. Je
vous serai toujours reconnaissante de m'avoir manifesté votre entière disponibilité,
d'avoir toujours répondu favorablement à mes nombreuses sollicitations malgré les
lourdes et innombrables charges qui pèsent sur vous; vos critiques, suggestions et
observations m'ont permis d'améliorer la qualité de ce document.
Je tiens à vous
exprimer ma profonde gratitude pour avoir accepté de présider ce jury de thèse.
A Monsieur le Professeur Emile Duhoux, vous avez dirigé ma thèse içi à Dakar et
au BSFf de Nogent sur Marne (France) . Je vous serai toujours reconnaissante pour vos
avis indispensables et vos conseils éclairés et pour votre disponibilité. Vous m'avez fait
bénéficier de vos connaissances et de votre immense expérience scientifique, de votre
sens pédagogique et de votre rigueur dans le travail. Vos critiques, suggestions et
conseils m'ont accompagnée durant toute la longue période d'élaboration de ce document
~ vous avez toujours répondu à mes nombreuses sollicitations malgré vos nombreuses
responsabilités administratives et scientifiques au BSFf et à l'Université Paris VII. Je
voudrai vous dire aussi que j'ai eu grand plaisir à travailler sous votre direction et je
souhaite vivement avoir de nombreuses et fructueuses collaborations dans le futur.
A Monsieur Je Professeur Antoine Nongonierma, je vous remercie de m'avoir
fait bénéficier de votre profonde sagesse et de votre immense expérience. En acceptant de
juger ce travail, veuillez trouver içi l'expression de ma reconnaissance et mon profond
respect. Soyez assuré de ma profonde gratitude.
A Monsieur le Professeur Mouhamadou Lamine Thiam pour sa confiance et sa
sympathie. Je vous serai toujours reconnaissante de vos témoignages de confiance qui
nous ont été d'un grand réconfort. Veuillez trouver içi l'expression de notre profond
respect, de notre grande estime et de nos remerciements sincères pour avoir accepté de
juger ce travail.
A Monsieur Bernard Dreyfus Directeur de Recherches à l'üRSTüM, je tiens à vous
témoigner toute ma reconnaiassance pour votre bienveillante générosi té, votre confiance
et votre soutien constants et infaillibles. Vos encouragements et votre disponibilité m'ont
été d'un grand apport. Je me sens trés honorée que vous ayez accepté de juger ce travail
et d'en être le rapporteur.
A Monsieur Mékinto Batcho Maître de Conférences, je vous suis particulièrement
reconnaissante de l'intérêt que vous avez toujours manifesté pour ce travail. Je tiens à
vous témoigner toute ma gratitude pour l'aide inestimable que vous m'avez apportée lors
de l'élaboration de ce document, pour vos conseils enrichissants, votre esprit critique et

2
a-2) Nodule à croissance indeterminée
53
7- Diversité taxonomique et spécificité des Rhizobium (s.l.)
53
7-') Diversité taxonomique
54
7-2) Spécificité des souches de Rhizobium (s.l.)
55
Chap IV}
Matériels et Méthodes
A) Biologie de la reproduction chez Acacia albida
59
,- Situation géoclimatique de la région étudiée
2- Localisation des arbres étudiés
3- Etude phénologique et morphologique des organes floraux
4- Etude de la stratégie reproductive chez Acacia albida
4-') Receptivité stigmatique
4-2) Vibilité du pollen d'Acacia albida
_4-3) Pollinisation controlée
B) Micropropagation végétative chez Acacia abida
,- Micropropagation par bourgeonnement axillaire
63
2- Embryogénèse somatique
65
3- Culture de racines excisées
66
C) ETUDE DE LA SYMBIOSE Rhizobium/ Acacia albida
67
1- Etude des paramétres de la fixation biologique de l'azote atmosphérique
68
'-') Matériel végétal
68
1-2) Influence du substrat de culture
68
'-3) Influence de la nature de la souche
68
'-3- 1) Dispositif en serre
68
1-3-2) Dispositif en tube de culture
69
'-4) Influence de l'ablation de l'apex racinaire
'-5) Influence des réserves azotées cotylédonaires sur
la croissance initiale et la fixation biologique de l'azote
2) Paramétres mesurés
2-') Infectivité des souches
7'
2-2) Effectivité des souches
7'
3) Etude des premiers stades de l'infection par Bradyrhizobium
72
Chap.V RÉSULTATS
A) Biologie de la reproduction
74
'-Phénologie
75
2- Cartographie du rameau inflorescentiel
75
3- Dynamique de la floraison
75
4- Morphologie florale
76
5- Etude de la reproduction chez A. albida
78
5-') Fructification
78

3
5-2) Réceptivité stigmatique
79
5-3) Qualité et viabilité du pollen
80
A) Test FCR
80
8) Germination "in vitro"
80
8-1) Optimisation des conditions de germination "in vitro
8-1-1)- Développement des tubes polliniques
81
8-1-2)- Influence de la composition minérale du
milieu de culture
81
8-1-3)- Influence du saccharose
81
8-1-4)- Influence du pH
82
8-2 ) Test de viabilité par la capacité de germination "in
vitro"
82
5-4)
Pollinisation controlée
83
6-Discussions
6-1) Phénologie et dynamique de la floraison
85
6-2) Structures reproductrices et stratégies reproductives
85
a)- Rapport monade /ovule
85
b)- Détermination du système de reproduction
(autogamie ou allogamie) par les tests de pollinisation contrôlée
86
6-3 ) Effort reproductif et qualité du pollen
88
a) Effort reproductif
88
b) Réceptivité stigmatique
88
c) Qualité du pollen
89
8) MULTIPLICATION VéGéTATIVE
92
1- Micropropagation par culture de nœuds axillaires
92
1-1) Influence de la saison sur l'expression morphogéne des explants
92
1-2) Influence de divers facteurs susceptibles d'améliorer
la reprise de croissance du matériel végétal
92
1-2-1) Réduction de l'oxydation des polyphénols
92
1-2-2) Influence de la nature du matériel végétal
94
1-2-3) Influence du mode d'obturation des tubes
94
1-2-4) Influence du charbon actif
95
, -3) Influence de la composition des différents milieux de culture
95
1-3-1) comparaison de quatre milieux minéraux
95
- bourgeonnement axillaire
95
- Elongation et morphologie des pousses feuillées
96
1-3-2) Influence de la dilution du milieu de base M-S
97
1-3-3 ) Influence de la source azotée
97
1-4) Etude de facteurs susceptibles de prévenir l'abscission foliaire
100
1-4-1) Fréquence des transferts sur milieux neufs
100
1-4-2) Addition de substances organiques
101
1-5-) Multiplication
101
1-6) Enracinement
102
1-6-1) Influence du milieu de base
102
1-6-2) Influence de la nature et de la concentration en auxine
103
1-6-3) Influence de la pré-culture sur milieu enrichi en
phloroglucinol
103

4
1-7) Conclusions et Discussions
105
A) Saison
105
B) Origine du matériel végétal
105
C) Réduction de l'oxydation des polyphénols par pré-trempage
106
D Fréquence de repiquage
106
E) Milieux minéraux de base
107
F) Nutrition minérale et organique azotée
107
G) Abscision foliaire
109
H) Taux de multiplication
110
1) Enracinement
110
J) Phénomène de croissance épisodique
110
2- Embryogénèse somatique
113
2-1) Production de cal
113
2-1-1) Influence de l'AIA
113
2-1-2) Influence du 2-4D
113
2-1-3) Induction de l'embryogénèse somatique par addition de BAP
114
2-1-4) Influence de l'addition de J'hydrolysat de caséine et d'un
mélange d'acides aminés
114
2-2) Histologie des cals obtenus
115
2-3) Discussions
116
3- Culture de racines excisées
118
3-1 ) Description de l'apparition des bourgeons végétatifs adventifs
118
3-2) Influence de la longueur ou de l'âge des explants
118
3-4) Influence du diamètre des explants
1 19
3-5) Influence du génotype
119
3-6) Influence de la composition du milieu de culture
1 19
3-7) Influence de diverses substances hormonales
120
3-7-1) Cytokinines et caulogénèse
120
3-7-2) Cytokinines et formation de racines latérales
121
3-8) Influence de substances à action cytokinique
121
3-8-1)
Phényl-urée
121
3-8-2)
Polyamines
1 21
3-9) Efficience relative des diverses substances à action cytokinique
122
3-10) Maintien du pouvoir caulogène
123
3-11 )Enracinement des pousses obtenues par culture de racines excisées
123
3-12) Histologie des bourgeons adventifs
123
3-13) Acclimatation
124
3-14) Discussions
125
a) Age et origine des tissus racinaires
125
b) Milieux et conditions de culture
125
c) Plasticité et conformité morphogénètique
127
D) Etude de la symbiose fixatrice d'azote atmosphérique
130
1- Influence du substrat
130
A- Croissance et morphogénèse
130
B- Nodulation
130
C- Teneur en éléments nutritifs du substrat
130
D- Discussions
131

5
2- Influence de l'inoculation avec differentes souches de Rhizobium (s.1)
133
2-1) Expérience menée en serre
133
A) Croissance et biomasse
133
B) ARA et SARA
133
C) Azote total de la plante
134
D) Corrélation entre les differents paramétres mesurés
134
2-2) Etude de l'effectivité des souches en tubes de culture
134
A) Efficience des souches
135
B) Cinétique de la nodulatioh en présence de differentes
souches
136
2-3) Influence de la date de l'inoculation
136
2-4) Discussions
136
A) Spécificité de l'association Rhizobium(s.l.) / A. albida
136
B) Activité fixatrice d'azoté
139
C) Date de l'inoculation
139
3- Influence de la morphologie du système racinaire
140
3- 1) Expérience menée en serre
141
3-2) Expérience menée en tube de culture
141
a- 1- Efficience nodulaire
141
a-2) Cinétique de la formation des nodules "in vitro"
141
3-3) Discussions
142
4- Influence des réserves cotylédonaires sur la croissance et la fixation d'azote
143
4- 1) Paramétres de croissance
143
4-2) Quantité d'azote fixée
144
4-3) Azote total des plantes
144
4-4) Discussions
145
5) Observation des premiers stades de l'infection racinaire et formation du nodule
148
5- 1) Infection racinaire et evolution du nodule
5-2) Discussions
Chap VI)
CONSIDERATIONS GENERALES
152
Chap
VII)
BIBLIOGRAPHIE
158
Chap VIII)
ANNEXES
178

INTRODUCTION

8
Acacia albida
encore appellée Faidherbia albida est une espèce de légumineuse
arborée bien connue par la plupart des acteurs du développement et des scientifiques de la
zone sahélienne. Son impact sur la fertilité du sol et sur la nutrition du bétail ont été bien
étudiés (Charreau et Vidal (1965),
Dancette et Poulain (1968), Fall (1978 ), Cissé et
Koné (1992)).
En dépit de son intérêt évident, les parcs à A. albida sont, depuis plus de 30 ans, en
déclin croissant dans le bassin arachidier au Sénégal. Les peuplements d'Acacia albida sont
trés âgés, les houppiers sont trés lâches à cause de l'émondage fréquent et des tailles
intensives (Dancette et Niang,1 979) entraînant un appauvrissement des sols et une baisse
de pro~uctivité (Mc Gahuey, 1992).
Au Burkina Faso également on a noté la disparition des parcs à A. albida entre
les fleuves Nakambé et Nazinou à l'Ouest et au Nord de Bobo-Dioulasso (Hervouet, 1992); ce
même phénomène a été rapporté au Niger (Torrekens et al., 1992), au Cameroun (Harmand
et N'Djiti, 1992) ainsi que dans le Djebel Mara au Soudan (Miehe,1 986).
En fait, l'absence d'une politique de gestion appropriée de protection des jeunes arbres ou
d'afforestation, a entraîné une raréfaction progressive des pieds; avec l'impact de la longue
période de sécheresse, les seuls sujets que l'on rencontre sont des sujets trés âgés qui ont été
sévèrement émondés dont la taille de la cime se réduit au fil des ans.
Lorsqu'on observe les parcs à A. albida, on est frappé de constater que la regénération
naturelle par les jeunes sujets est pratiquement absente; les prévisions pour les années à
venir sont trés alarmantes si aucune action n'est tentée en vue de remédier à cette situation,
car la mort de ces sujets âgés laissera un sol
complétement dénudé et totalement
improductif.
Face à ce probléme, et grâce à l'appui des projets nationaux de reboisement (ex au
Sénégal: le PREVINOBA, le PRECOBA et le Projet agroforestier du Senegal) et des ONG, les
paysans sont de plus en plus sensibilisés à la nécessité de mener des actions en vue de la
reconstitution du couvert végétal. Par des systèmes d'incitation, ils sont encouragés à
protéger les jeunes plants contre les feux de brousse, ou la dent du bétail et à favoriser leur
regénération naturelle (Baumer, 1988).
De plus les paysans réalisent de façon plus aigüe la nécessité d'intensifier en quelque
sorte les cultures; cependant, la trilogie "variétés à haut rendement-engrais-pesticides "
n'est plus une solution adaptée à nos agro-systèmes fragiles où les revenus sont
excessivement faibles et où l'absence d'une politique de subvention rend l'achat des facteurs
de production difficiles à supporter par les paysans eux-mêmes (Le Tacon, 1989).
Fort heureusement, depuis une quinzaine d'années, on note un intérêt grandissant et
manifeste aussi bien des autorités, des ONG que des associations villagoises, pour la

9
réhabilitation des pratiques agro-forestières seules capables de promouvoir une agriculture
durable en intégrant les espèces forestières à usages multiples qui constituent une ressource
considérable et contribuent à maintenir et à restaurer la fertilité des sols.
La prise de conscience de la nécessité de mener des recherches ,en agroforesterie
utilisant des espèces particulièrement adaptées aux conditions pédo-c1imatiques difficiles
telles que Acacia albida, A. senegal, A. raddiana, Prosopis juliflora, P. africana etc... , a eu
comme conséquence la mise en place de vastes programmes agroforestiers. Ces programmes,
menés au sein de différents instituts de recherche de la plupart des pays africains, visent
essentiellement à définir des systèmes arbres-cultures, compatibles et complémentaires
susceptibles de stabiliser et d'améliorer l'environnement tout en favorisant une production
alimentaire et en bois suffisante.
rarmi les différents systèmes identifiés, l'association A. albida - céréales, en raison
de son impact à long terme sur la productivité du sol et l'alimentation du bétail, a été
sérieusement envisagée comme une alternative pour promouvoir un développement agricole
durable.
Il demeure incontestable que cette espèce joue un rôle socio-économique important
pour nos populations rurales et pour la communauté scientifique, un défi à relever. Les
chercheurs s'intéressent de plus en plus à l'étude des conditions d'amélioration génétique des
potentialités de cette espèce ainsi que l'adaptation des pratiques sylvicoles dans un
environnement sahélien particulièrement difficile. pour
arriver à maintenir et à étendre
l'arbre dans son écosystème naturel.
C'est ce qui justifie l'intérêt de nombreux organismes tels que la FAO (Palmberg,
1986), la CEE (Joly, 1988) qui ont initié et encouragé des programmes d'évaluation de
conservation et d'amélioration des ressources génétiques chez A. albida , de même que des
instituts de recherche nationaux et internationaux (OR5TOM, CTFT-CI RAD. ICRI5AT, liTA,
ICRAF, ILCA) travaillant activement sur la physiologie, la génétique, l'écologie, la
sylviculture de cette espèce.
En matière d'amélioration des espèces forestières la stratégie repose sur trois
pincipes fondamentaux ( Libby, 1973; Haines, 1992 ):
1) la base génétique : identification des populations et des individus et
détermination de la variabilité génétique de l'espèce.
2) la biologie de la reproduction : la connaissance compléte d'une espèce
requiert des données sur son système de reproduction (allogamie ou autogamie), fa
pollinisation (écologie de la pollinisation) et du mode de dispersion des graines ; ainsi la
structure génétique de la population en question est étroitement dépendante de ces trois
facteurs qui sont liés et évoluent ensemble (Nikles,1992).

10
3) les méthodes de production: les méthodes adoptées sont étroitement liées
aux objectifs de production que s'est assignés l'améliorateur, aux limites de son
environnement naturel et aux contraintes de nature sodo-économique.
A partir de ces données, on tend à prendre en considération dans les stratégies
d'amélioration, trois niveaux hiérarchiques au sein des populations forestières:
1) la population de base qui constitue la base des ressources génétiques
d'une espèce. Cette population doit être gérée de façon idéale pour conserver sa diversité;
c'est à ce niveau qu'interviennent les études génétiques sur la structure des populations, sa
diversité, les méthodes de conservation au niveau de banques de génes
2) la population de croisements: qui est gérée de manière extensive à
long terme au niveau de verger à graines
3) la population de propagation qui est sélectionnée et gérée de manière
intensive de façon à produire dans un délai relativement court des clones à haute
performance.
Le matériel forestier est un matériel encore sauvage différant beaucoup des espèces agricoles
progressivement transformées par plusieurs générations de sélections; ainsi l'étendue de la
variabilité génétique n'est que partiellement connue et les potentialités dont recèle l'espèce
ne sont pas encore totalement explorées.
Nos travaux s'intègrent dans un schéma global d'amélioration forestière tel qu'il est
défini ci-dessus, et nous nous sommes ainsi attachés à intervenir sous trois aspects
essentiels:
1) En étudiant la biologie de la reproduction chez Acacia albida, nous avons cherché
comprendre la stratégie développée par l'espèce pour se reproduire, en déterminer les
modes de floraison et de fécondation de manière à pouvoir mettre l'accent sur les facteurs
limitants de la production de semences au niveau des peuplements naturels.
2) D'autre part, le matériel forestier est caractérisé par une maturité sexuelle
tardive (10 à 20 ans selon les espèces) ce qui allonge les cycles de sélection, dans un milieu
naturel présentant une grande variabilité. Par conséquent les voies d'approche que nous
avons à choisir devront être rapides, évolutives et souples permettant d'obtenir des gains
maximum en un temps relativement court (1 à 2 générations). La propagation végétative

I l
constitue une alternative intéressante pour capturer rapidement un gain génétique à partir
d'une population sélectionnée; c'est ainsi que dans le cadre de ce travail, nous avons utilisé
l'outil "biotechnologie" pour définir les conditions optimales et les limites de la regénération
"in vitro" de sujets adultes et d'individus juvéniles chez Acacia albida .
3) L'association avec des souches de Rhizobium fixatrices d'azote constitue un élément
important pour augmenter les performances individuelles et pour une meilleure adaptation
aux conditions pédo-c1imatiques défavorables du Sahel.
Notre objectif à l'issue de ce travail de recherche est de pouvoir définir des voies d'approche
méthologiques
pouvant d'une part contribuer à la conservation et à l'amélioration des
ressources génétiques et d'autre part, conduire à une meilleure maîtrise du potentiel
génétiq"u.e d'Acacia albida.

OBJECTIFS

13
A) BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION
Il apparait que de nombreuses études ont été menées sur les systèmes de reproduction
d'espèces africaines, asiatiques et australiennes d'Acacia. Cependant chez Acacia albida
hormis l'étude effectuée par Guinet (1969), Wickens, (1969) et Tybirk et Jorgensen
(1991), il existe peu d'informations détaillées relatives à la biologie de sa reproduction.
Les stratégies d'amélioration développées au Sénégal sur les espèces d'Acacia, en dehors de la
propagation végétative, sont essentiellement basées sur des tests de provenances et des tests
de descendance (plein fréres, demi-fréres) en vue de la mise en place de vergers à graines
pour la production de semences de qualité.
Il nous est apparu nécessaire de mieux cerner la stratégie mise en oeuvre par l'espèce pour
se propager dans son environnement; en étudiant le type de comportement vis à vis des
insectes pollinisateurs et le système de reproduction (allogamie ou autogamie), nous nous
proposons d'apporter des éclaircissements sur la biologie de la reproduction chez A. albida .
En effet, au sein des populations naturelles, la plupart des espèces d'Acacia sont auto-
incompatibles ce qui favorise un niveau élévé d'hétérozygotie. Ce type de reproduction à
prédominance allogame dans un système panmictique est favorisé en raison de la supériorité
des combinaisons hétérozygotes ou des hybrides dans un environnement naturel trés sélectif.
Mais il existe divers degrés d'auto-incompatibilité; A. albida est suspectée d'avoir un
mécanisme d'auto-incompatibilité, nous nous proposons au cours de
ce travail de
déterminer le niveau d'allogamie chez cette espèce.
'estimation quantitative du niveau d'auto-incompatibilité reposant sur la possibilité de
mettre en place un protocole de fécondation contrôlée, nécessite au préalable des
informations relatives d'une part à la période de réceptivité stigmatique et d'autre part à la
qualité du pollen utilisé.
En effet, en l'absence de traitement conservateur, le pollen d'Acacia présente une viabilité
limitée dans le temps. Il apparait dés lors indispensable de pouvoir définir, grâce à des tests
de viabilité rapides et fiables, les limites de la viabilité du pollen d'A. albida de façon à éviter
une perte de temps qui résulterait de l'utilisation de pollen non viable au cours des
croisements contrôlés.
Par conséquent il apparait vital de réunir des informations nécessaires et adéquates
sur la biologie de la reproduction chez A. albida afin d'une part, choisir et de développer la
stratégie d'amélioration la mieux adaptée et d'autre part d'identifier les facteu
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susceptibles de limiter la production de semences au niveau des peuplements naturels. / o~<:-o:. ---------
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B) MICROPROPAGATION VÉGÉTATIVE CHEZ ACACIA ALBIDA
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Chez les ligneux forestiers les voies les plus utilisées en vue de la propagation e '_
masse, concernent la regénération par bourgeons terminaux et axillaires (par culture de

14
nœuds, d'apex et de méristèmes) par induction de bourgeons adventifs sur des organes
différenciés et destinés vers un autre type de morphogénèse ou par formation d'embryons
somatiques. Les deux premières voies (caulogénèse à partir d'organes pré-existants et
caulogénèse adventive) sont les plus fréquemment suivies puisqu'elles sont trés fructueuses.
La 3ème voie par embryogénèse somatique, si elle réussit, permet de maximiser le taux de
multiplication ; elle est cependant la moins utilisée car de nombreuses espèces sont
récalcitrantes à cette technique.
Le développement d'un système de propagation c10nale chez A. albida doit être considéré sous
l'angle global de l'amélioration des techniques de macro-propagation ; en effet chez A. albida,
le bouturage classique de sujets adultes pose encore de nombreuses difficultés liées au choix
du matériel à bouturer, à l'époque de prélèvement, et au faible taux d'enracinement obtenu
(21 %) (Danthu, 1992). Cette méthode est lente et nécessite beaucoup de temps (120 jours
en moyenne pour obtenir des boutures racinées).
Le but principal de notre travail est d'établir un système reproductible et efficace de
regénération de génotypes d'A. albida . Au cours de notre étude nous avons cherché à définir
un protocole permettant:
- d'induire rapidement une organogenese à partir de tissus partiellement
rajeunis prélevés sur des arbres matures et de déterminer les limites de la
micropropagation
- d'étudier les conditions optimales de regénération "in vitro" d'embryons
somatiques à partir de jeunes tissus
- d'éxaminer les facteurs responsables de la réponse organogène des explants
d'Acacia albida prélevés sur de jeunes racines et de définir les conditions nécessaires à une
bonne reproductibilité de la regénération "in vitro".
Ces clones obtenus devront constituer le point de départ d'une propagation par voie
traditionnelle et classique de génotypes sélectionnés.
La mise au point de ces techniques permettra d'établir des programmes d'amélioration
génétique qui combinent la sélection classique par croisements contrôlés au sein de
populations sélectionnées et la propagation par voie végétative de génotypes performants
issus de ces croisements. Ces individus pourront être sélectionnés sur la base de critères
bien définis (ex : production fourragère, aptitude à produire un système racinaire à forte
croissance (Ahée et Duhoux,
1993) ; aptitude à fixer de l'azote (Dreyfus et
Dommergues,1 988a»
.

lS
C) SYMBIOSE FIXATRICE D'AZOTE ATMOSPHÉRIQUE
L'importance des ligneux à usages multiples est largement reconnue. En zone aride et semi-
aride, les ligneux fixateurs d'azote indigénes qui sont bien adaptés aux conditions
défavorables de leur milieu naturel, sont de plus en plus utilisés pour l'afforestation de ces
régions dégradées et improductives, afin de restaurer la fertilité des sols et rétablir un bon
équilibre écologique; ces espèces perennes, en plus de leur parfaite adaptation aux conditions
climatiques sahéliennes, présentent l'énorme avantage
de pouvoir fixer l'azote
atmosphérique et de se développer sur des sols carencés en azote. Parmi les espèces les
mieux étudiées, on peut citer les espèces du genre Acacia (Duhoux et Dommergues, 1986;
Dreyfus et Dommergues,1988a), Casuarina (Dreyfus et aL, 1988; Sougoufara et aL, 1989;
1990;~arriotti et aL,1991; ), Leucaena (Sanginga et aL, 1988;1989; 1990), Prosopis
(Jordan- et aL, 1990; Diagne et Baker, 1992). Toutes ces espèces végétales sont connues
pour leurs potentialités multiples en matière de production de fourrage, d'amélioration de la
fertilité des sols et d'utilisation du bois de feu.
L'étude que nous avons menée en matière de symbiose fixatrice d'azote atmosphérique
comporte différents volets :
1- A. albida est connu pour son rôle améliorant de la fertilité du sol.
L'accumulation d'éléments nutritifs en vue d'augmenter le niveau de fertilité des sols peut
s'effectuer par l'intermédiaire soit de la fixation biologique de l'azote soit par recyclage de la
matière organique à partir de feuilles ou à partir de déjections du bétail soit enfin par
remobilisation des nitrates à partir des couches les plus profondes.
Récemment, il est apparu que cet effet améliorant sur les propriétés biologiques et
physico-chimiques du sol appellé "effet "albida " serait dû à la pré-existence de micro-sites
favorables, des îlots de fertilité, liés à la présence d'anciennes termitières sur lesquelles
l'arbre se développe de préférence (Geiger et Van den Belt, 1992).
Notre objectif est de comparer le développement de jeunes plants d'A. albida inoculés sur
deux types de sols : un sol riche en matière organique et en éléments minéraux et un sol
squelettique et pauvre en ces éléments, et de suivre la dynamique des éléments nutritifs
avant la culture et aprés la culture.
2- A. albida est nodulé généralement par des souches de Bradyrhizobium ;
mais il est apparu que des souches de Rhizobium (ss) à croissance rapide peuvent noduler
cette espèce. Nous avons cherché à déterminer l'efficience de deux groupes d'espèces de
Rhizobium à croissance rapide et de Bradyrhizobium (à croissance lente) en association avec
A. albida.
L'étude de l'éfficience des souches a été menée à la fois en serre et en tubes de culture.

16
Le dispositif de culture "in vitro" de plantules en conditions axéniques où on apporte une
quantité déterminée d'éléments nutritifs, de rhizobium où on définit les paramètres de
température, de luminosité, d'hygrométrie est un dispositif standard permettant d'étudier de
façon détaillée la nodulation et les paramètres pouvant influencer le mécanisme biologique de
la fixation d'azote.
Nous nous sommes inspirés d'un dispositif mis au point sur Acacia mangium (Galiana et al.,
1991) pour étudier "in vitro" les facteurs pouvant affecter ou stimuler la fixation en
particulier la souche de rhizobium, la date de l'inoculation le nombre de sites potentiels de
formation des nodules. Ce dispositif permet aussi de suivre visuellement la cinétique et la
localisation des sites de formation des nodules sur les racines plantule par plantule. En
doublant les expériences, en serre et en tubes, nous avons voulu tester la similarité des
réponses obtenues dans les deux conditions, de façon à mener ultérieurement nos expériences
d'inocül~tion en tube avec un dispositif de choix favorisant l'observation des nodules.
3- l'influence de la morphologie racinaire (traçant et superficiel ou pivotant
et profond) sur la fixation biologique de l'azote.
L'apex racinaire comme tout méristème principal exerce une forte dominance sur les
racines secondaires et par conséquent sa croissance s'effectue au détriment des racines
secondaires qui sont inhibées. Si on supprime cette dominance du méristème apical, on peut
favoriser l'augmentation de la ramification latérale et par là augmenter le nombre de sites de
nodulation.
L'étude de la morphologie du système racinaire sur le potentiel de fixation d'azote
atmosphérique a aussi été menée en dispositif "in vitro".
4- Chez A. albida la graine contient un embryon possédant des cotylédons; ces
cotylédons contiennent une importante quantité de substances de reserves ; parmi celles -ci,
l'azote contenu dans les tissus cotylédonaires se trouve en proportion appréciable ( 4,5% du
poids sec chez A. albida contre 3.0% chez A. nilotica et 3.2% chez A. tortilis) ( Reed et al.,
1992).
De précédentes études sur les provenances Nord (avec un enracinement pivotant et trés
profond) et Sud (poussant les pieds dans l'eau avec un enracinement traçant), avaient
montré que la provenance Sud av_ec un système racinaire traçant avait la particularité de
présenter des gousses d'une taille supérieure'à la moyenne et des graines plus volumineuses
et plus lourdes que les autres provenances du Nord (Dianda, 1993; Chevallier et al.,1992
) .
Or, il a été constaté que les plants inoculés de la provenance Sud étaient plus vigoureux, et
contenaient une plus grande quantité d'azote totale au cours des premiers stades de
développement que la provenance Nord (Dianda, 1993).
Ce sont ces considérations qui nous ont amenés à étudier:

17
- la part respective des réserves azotées cotylédonaires et de la fixation biologique
de l'azote dans l'estimation de l'azote total d'une plante.
En enlevant partiellement ou entièrement les cotyledons, nous avons cherché à déterminer
l'influence des cotylédons sur la croissance et la fixation biologique de l'azote.
-De même en ajoutant une faible quantité d'azote sous forme d'azote starter 7 jours
aprés l'inoculation, nous avons cherché à déterminer dans quelle mesure l'azote exogéne peut
affecter l'efficience de la fixation d'azote.
5- Etude anatomique de l'infection
L'utilisation d'une méthode efficace d'observation de racines infectées (Truchet et al.,1989),
nous a. permis de déterminer les premiers stades de l'infection par le Bradyrhizobium chez
A. albida.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

PlANCHE N° 1
Acacia
albida : Phénologie inversée
Fig. A : Acacia albida en pleine feuillaison au mois de Janvier en saison sèche. Noter
. la forme du houppier en parasol.
Fig.B: Peuplements d'A. albida dans la zone de Bambey; les arbres sont trés âgés et
la regénération naturelle est pratiquement absente; nous sommes en saison des
pluies et l'arbre se trouve en association avec le mil; noter la différence de
croissance du mil sous le houppier et en dehors du houppier.

A
B

19
A) PRESENTATION DE L'ESPECE
Acacia albida encore appellée Faidherbia albida est une Mimosacée typique de l'Afrique aride
et sub-aride, caractérisée par une phénologie inversée par rapport aux autres caducifoliées
tropicales (feuillaison en saison sèche, défeuillaison en saison des pluies )(P!. 1 fig A et B).
Acacia albida est un arbre de grande taille (15 à 20 m) pouvant atteindre 30 m de hauteur;
il est caractérisé par la forme de son houppier hémisphérique en pyramide inversée.
L'écorce est de couleur brune, fissurée et écaillée chez les arbres agés. La feuille est
composée bi-pennée; les foliolules sont glabres à pubescentes, oblongues et dans certains
cas mucronées. L'espèce présente des épines stipulaires droites et épaissies à leur base (fig.
1).
Le nombre chromosomique de base est 2n= 26 (Atchinson, 1948) mais il n'est pas
rare de rencontrer des individus tétraploïdes (2n=4x=S2) (Halevy, 1971).
Son aire de répartition couvre une étendue trés importante, allant du Cap-Vert à la Somalie
dans le sens Est-Ouest puis descendant vers la côte australe jusqu'au Nord de la frontière
Sud-Africaine (Brenan,1983). Son aire est limitée par la forte humidité permanente qui
interdit sa présence en zone forestière dense (Fig. 2).
En dehors de l'Afrique on peut rencontrer de façon sporadique des peuplements d'Acacia albida
au Yemen, en Israël en Jordanie et au Liban (Karshon, 1961).
L'origine probable de cette espèce serait vraisemblablement l'Afrique de l'Est par où la
plupart des espèces d'Acacia auraient divergé (Ross, 1981); cette hypothése est étayée par
l'analyse génétique par électrophorèse des isoenzymes qui a montré que les allèles les plus
fréquents au sein des populations d'Afrique de l'Est sont généralement les plus rares
en
Afrique de l'Ouest (Joly et Faggs C. comm pers.) et que l'espèce aurait considérablement
évolué en intégrant de nouveaux allèles pour s'adapter à des écotypes trés divers et en en
perdant d'autres par dérive génétique.
On distingue chez cette espèce deux races géographiques caractérisées par leur
morphologie basée sur la pubescence et sur la longueur des foliolules :
- la race A à feuilles et tiges glabres et des foliolules de petite taille (6mm)
- la race B à feuilles et tiges pubescentes et foliolules plus larges (1 2 mm)
Cependant, il existe de nombreuses formes intermédiaires entre ces 2 races. La race
A se retrouve essentiellement en Afrique australe et orientale alors que la race B est
prédominante au Soudan et en Afrique de l'Ouest (Fig.2). Nongonierma (1978) a distingué
quatre taxons dans la population de l'Afrique de de l'Ouest.
Au Kenya, en Somalie, en Tanzanie, et en Ouganda, la race A n'est pas grégaire; -on la retrouve
dispersée le long des cours d'eau alors que la race B se retrouve à partir du sud de la
Tanzanie vers le Sud de l'Afrique formant d'importants peuplements monospécifiques (Faggs,

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1000 km
Fig 2: Carte de disUibution géographique d'Acacia albida (CfFT,1989)

20
1992) dans des zones généralement trés peuplées et où l'extension des arbres est en partie
dûe à l'influence de l'homme et du bétail.
1- ECOLOGIE
Espèce trés plastique (Nongonierma, 1978), on la retrouve dans divers biotopes à
différentes altitudes (-270 m à 2700 m ) aux abords des cours d'eau, sur des
sables
dunaires profonds où son système racinaire pivotant peut atteindre la nappe phréatique à 40
m de profondeur, sur des sols sablo-argileux ou limoneux ou légèrement hydromorphes
(Nongonierma, 1978; CTFT, 1988). En Afrique australe, l'espèce se développe sur des sols
alluviaux calcimorphes, sur sols ferrugineux ou ferralitiques, sur vertisols et sur sols
argileux.
Dans le Djebel Mara au Soudan, l'espèce se développe à des altitudes variables de 300 à 1000
m caractérisées par une pluviométrie allant de 50 à 1165 mm étalée entre 0 et 5 mois sur
des sols profonds trés poreux constitués de cendres volcaniques relativement pauvres en
matière organique et légèrement acides (Miehe, 1986).
Aù Malawi (Faggs, 1992) on la retrouve se développant sur des bancs de sable où elle
résiste bien à l'inondation, en Namibie et en Zambie, l'espèce croît plus fréquemment autour
des lacs, le long des cours d'eau et sur les zones de plateaux.
En Ethiopie, A. albida se trouve éparpillée au niveau des zones régulièrement inondées le long
des cours d'eau dans les zones de savannes ; l'espèce croît en peuplements purs dans les
zones habitées où les paysans la maintiennent de préférence par rapport aux autres espèces
(Laike ,1992).
Le systèm,e racinaire pivotant allant chercher l'eau à de trés grandes profondeurs, est
considéré comme une forme d'adaptation à la sécheresse; par ailleurs, le type de racine
pivotante est caractéristique de sols profonds sableux et tres poreux; par contre dans les
zones inondées régulièrement comme les zones de rizières et sur sols argileux, les individus
qui s'y développent présentent un système racinaire non pas pivotant mais superficiel et
trés traçant (Dreyfus B. comm personnnelle), (Alexandre et Ouedraogo, 1992) .
Tres récemment une nouvelle approche a été envisagée par Geiger et al., (1992) qui
suggérent que l'''effet albida" se caractérisant par une augmentation des rendements à
l'approche de la ca nopée ne serait pas totalement liée à l'arbre mais plutôt au fait que l'arbre
choisit et s'implante préférentiellement sur des micro-sites favorables; ces micro-sites
favorables sont à relier avec la présence de termitières qui apportent une quantité
importante d'argiles (Brouwer et al., 1992).

21
2 -POSITION SYSTEMATIQUE
L'espèce a été pour la première fois identifiée par Delille en 1813 (cité par Wood,l 992)
sous le nom d'Acacia albida Del. puis Bentham (1875) reconnut l'espèce comme appartenant
aux Mimosoidae, sous -famille des Leguminosae dans la série des Gummiferae. Le genre
Acacia comprend prés de 1200 espèces.
Acacia albida est une espèce qui présente de nombreux caractères qui la distinguent des
autres espèces du genre Acacia:
- La soudure des filets staminaux à leur base pour former un anneau entourant le
gynécée (Baillon, 1863)
.: la phénologie inversée: l'espèce perd ses feuilles en saison des pluies et les garde
en saison sèche
- au cours des premiers stades du développement de la plantule, les feuilles
primordiales formées sont bi-pennées alors que tous les autres Acacia présentent des
feuilles primordiales avec un seul penne (Vassal, 1979)
- Les cotylédons sont sessiles alors que les autres membres de la tribu des
Gummiferae présentent des cotylédons pétiolés (Robbertse, 1974).
- Les grains de pollen sont dépourvus de crêtes, sont tri-colporés et possèdent une
éxine réticulée comparable à celle des Ingeae (Guinet, 1969).
- L'anatomie du bois est différente de celle des autres Acacia (Robbertse et al., 1980)
par sa structure en couche et par ses rayons droits.
Ces caractères sont spécifiques et propres à Acacia albida et ne se rencontrent même
pas chez des espèces proches parentes. C'est pour cette raison que Chevallier (1934)
préféra exclure cette espèce du genre Acacia et la situer dans le genre monospécifique
Faidherbia albida. Cette modification dans la nomenclature botanique établit en même temps
la liaison entre la tribu des Acaciae et celle des Ingeae ; cette nomenclature n'a pas été
totalement adoptée et la position systématique n'est pas à ce jour clarifiée.
3 - VARIABILITE GENETIQUE
En cherchant à déterminer l'étendue de la base génétique, des travaux ont montré une trés
grande dispersion de l'espèce dans le continent africain.
Des efforts considérables ont été menés dans la collecte et l'identification des provenances en
Afrique de l'Ouest et en Afrique de l'Est (FAO 1980 ; Faggs ,1992).

22
Des études menées sur la variabilité morphologique des gousses (forme, taille,
couleur et enroulement) ont montré une trés grande variabilité entre les provenances et au
sein des provenances (Ross, 1966) sans que l'on puisse mettre en relation ces variations de
la gousse avec les différents types morphologiques observés et leur origine géographique
(Chevallier et aL,1992).
Du point de vue phénologique des études menées en Afrique Australe ont montré là
aussi une grande variabilité dans les stades phénologiques au niveau d'une même localité et
entre localités différentes (Faggs,1992) ; le cycle phénologique est trés étalé et il a été
observé des specimens dans le désert namibien qui, en dehors d'une période de deux semaines
où ils sont totalement défeuillés, conservent leurs feuilles toute l'année.
De nombreux essais de provenances ont été réalisés au Sénégal, (Cazet, 1987) au
Burkina Faso (Billand et de Framont, 1986) et au Zimbabwe (Sniezko et Stewart, 1989 ),
au Cameroun (Harmand et N'Djiti, 1992) à Dosso au Niger (Torrekens et aL, 1992).
La plupart de ces essais ont montré que les provenances locales sont généralement les plus
performantes et que les provenances d'Afrique Australe en particulier celles du Burundi ne
sont pas du tout adaptées aux conditions sahéliennes.
Une comparaison entre les provenances de l'Afrique de l'Ouest et de l'Afrique de l'Est a
montré des différences trés nettes au point de vue des caractères de poids et taille des graines
(en particulier les graines originaires de l'Afrique de l'Est sont en moyenne deux à trois fois
plus volumineuses que celles de l'Afrique occidentale), la croissance
juvénile et la
nodulation.
Par ailleurs, pour différencier les paramètres purement génétiques des paramètres
liés à l'environnement, des études en électrophorèse sur la variabilité génétique ont été
menées ( Danthu et Pratt, 1991), (Joly et aL, 1992), (Faggs et aL, 1992) qui confirment
ce qui avait
été dejà constaté au niveau de la diversité géographique. Les populations
africaines d'Acacia albida (H=O,454) sont de loin beaucoup
plus diversifiées que les
populations d'Acacia originaires d'Australie; il semble que cette diversification doive être
mise en relation avec sa distribution discontinue elle-même à relier à un certain niveau de
différenciation en vue de s'adapter aux différents types d'habitats et fou à une dérive
génétique. Ces études ont aussi montré qu'il éxiste une nette démarcation entre les
provenances d'Afrique Australe et Orientale et celles d'Afrique de l'Ouest.
4- IMPORTANCE DE L'ESPECE
En Afrique occidentale, la présence de l'Acacia albida
est essentiellement liée à
l'exercice d'une activité humaine locale qui est dans ces zones, de nature agro-sylvo-
pastorale.

23
En étudiant les sytèmes traditionnels, on se rend compte de la place prépondérante occupée
par cette espèce (Pelissier,1 966 et 1980).
Sa feuillaison mqjestueuse pendant la saison sèche dans des régions presque désertiques est
considérée comme un défi à la nature; c'est pour cela que le "kad" est presque partout
entouré de mythes socio-culturels et occupe une place prépondérante dans les croyances
religieuses.
En effet, au Niger, il y'a plus de 100 ans, les sultans du Zinder punissaient toute
personne qui abattait un Acacia albida .
Acacia albida
chez les Dogons est considéré comme un arbre qui prolonge la vie
(Bonkoungou,1992) .
En plus de ces mythes, les populations rurales connaissent l'importance agronomique de cette
espèce; en effet, l'arbre fournit ombrage et fourrqge au bétail durant la saison sèche. Au
Sénéga'l Acacia albida est une espèce depuis longtemps intégrée aux systèmes agraires
traditionnels.
L'expérience paysanne sérère a montré. "que le parc à Acacia albida autorise une
culture intensive sans jachère: c'est sous cet arbre que les cultures, notamment les céréales
donnent les plus forts rendements et les meilleures qualités de récolte " (Bonkoungou
,1987).
Des recherches menées à Bambey (Charreau et Vidal, 1965), (Dancette et Poulain,1 968)
(Jung, 1970), sur le rôle de l'Acacia albida dans l'amélioration de la fertilité du sol, ont pu
démontrer une augmentation de la teneur en matière carbonée et en eau du sol ainsi qu'une
activité biologique intense sous le couvert de l'arbre. Au Cameroun des essais agroforestiers
ont été effectués et ont permis de déterminer l'impact positif de l'arbre sur le rendement des
cultures associées de mil et Sorgho (Eyog-Matig et Peltier, 1988).
Les differentes hypothèses émises concernant l'action de recyclage de la litière ou
l'apport de fumure par le bétail qui stationne sous la canopée ou la fixation biologique de
l'azote atmosphérique, sont sans nul doute appréciables, et chacun des facteurs contribuant
pour sa part à l'amélioration de la fertilité du sol.
Outre l'action améliorante d'Acacia albida sur le rendement des cultures, cette espèce
constitue par ses feuilles et ses gousses une excellente source de fourrage en saison sèche.
Les premières gousses apparaissent à l'âge de 8 ans (Nongonierma, 1978). La production de
fruits varie entre 125 - 135 Kg par arbre de 230 m2 de surface de la cime (Jung 1967;
Wickens 1969).
La biomasse foliaire à l'optimum de végétation (mois de janvier) est estimée à 300 kg de
matière sèche par Hectare; les feuilles contiennent 200 g de matière azotée par kg de
matière sèche alors que les gousses en renferment 150 g et les graines 240 à 280 g
(Wickens, 1969).
5- PHENOLOGIE

24
Le rythme phénologique inversé a beaucoup intrigué de nombreux chercheurs qui ont à leur
manière tenté d'émettre des hypothèses pour expliquer ce phénomène.
Selon Capon (1947), la présence de l'Acacia albida dans les zones de bas-fonds trés
humides favoriserait le maintien de son feuillage au cours de la saison sèche.
Trochain (1969) pense que l'arbre aurait migré vers le Nord méditerranéen lors d'une
période humide ; il aurait ainsi acquis le rythme méditerranéén des pluies hivernales ; à la
suite d'une phase de sécheresse, son aire se serait à nouveau déplacée vers le sud mais
l'espèce aurait malgré tout conservé ce rythme phénologique.
Selon Giffard, 1964 l'arbre est originaire de l'hémisphère Sud ; il aurait gardé dans
l'hémisphère Nord où il s'est adapté le rythme biologique de l'hémisphère Sud.
,
Selon Lebrun
(1968)
et Halevy (1971),
le rythme
phénologique
inversé est
essentiellement lié à l'engorgement des racines qui en créant des conditions d'anaérobiose
perturbe la synthèse des hormones et le métabolisme en général et provoque par conséquent
l'abscission foliaire.
Nongonierma (1978), en cherchant à démontrer l'hypothèsee de Lebrun a constaté que dés la
deuxième année de culture en conditions asphyxiantes, l'arbre reprend son rythme normal
par rapport aux témoins placés en conditions non asphyxiantes.
Il en a par conséquent conclu que la défeuillaison au cours de la saison des pluies est un
phénomène lié non pas aux conditions du sol mais à "des stimuli endogénes et rythmiques ".
En effet, il a été souvent observé une trés grande variabilité dans la périodicité du rythme
phénologique entre différents individus d'une population sur un même site; il nous est
arrivé de constater quelques pieds agés qui ont conservé leurs feuilles sur une ou deux
branches du houppier en saison des pluies; et dans le désert de Namibie (Faggs et Sames
1992), il existe des pieds d'A. albida qui gardent leurs feuilles pratiquement toute l'année.

25
B) BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION
De nombreuses études ont été menées sur la biologie de la reproduction chez les Acaciae.
Notre revue bibliographique en rappelle les points essentiels et ne concerne que le groupe
des Acacia australiens, africains et asiatiques.
1) VARIABILITÉ TAXONOMIQUE DES ACACIA
"Les Mimosacées constituent un groupe largement représenté dans les zones tropicales
africaines et australiennes. Au sein de ce groupe, le genre Acacia représenté par plus de
1200 espèces dont 700 endémiques en Australie est le plus important. C'est un groupe
relativement homogéne et où les subdivisions et les limites taxonomiques sont souvent
imprécises en raison d'une variation continue des caractères ( Guinet, 1969).
Cependant, il a été noté des niveaux inégaux de variation et des degrés divers d'évolution des
caractères au niveau des differents taxa observés (Guinet et Vassal, 1978).
En effet dans le but de clarifier la classification et les subdivisions dans le genre
Acacia, les critères de cytologie, de caractères du pollen, de la graine, de l'inflorescence, de
la gousse, de l'appareil végétatif ont été utilisés pour démontrer que la plupart des
caractères ne varient pas ensemble; cependant, en combinant ces différents caractères, il a
été possible d'identifier des voies de spécialisation en relation avec la répartition
géographique des espèces.
Le genre Acacia constitue un groupe trés évolué au point de vue des caractères
cytologiques (nombre chromosomique et caryotype) par rapport aux autres genres de la
famille des Mimosacées et il se distingue des autres genres par un niveau élevé de
spécialisation et ses caractères cytologiques sont d'une grande diversité (Guinet et Vassal,
1978). En effet, dans le genre Acacia, le noyau est de petite taille et le caryotype présente
une trés grande hétérogénéité; d'autre part, le nombre chromosomique de base est 2n= 26
mais on y distingue une grande variété de diploides, tetraploides, octoploides et 16-ploides
avec certaines espèces telles que A. tortilis (Forssk.) Haynes subsp raddiana (Savi.) Brenan
qui possède un nombre intermédiaire de 78.
2)
ORGANISATION DE LA FLEUR
Le rameau inflorescentiel considéré comme la pousse florifère est soit un racéme soit un
panicule. En raison de la synchronicité des phases protogynes de l'ensemble des fleurs au

26
niveau d'une même inflorescence, on tend à considérer que chez les Mimosacées, l'unité de
reproduction n'est pas la fleur mais l'ensemble des fleurs goupées en inflorescence (Arroyo,
1981 Kenrick et knox, 1985). L'inflorescence
est constituée d'un ensemble de fleurs
groupées en glomérule ou en épi (Robbertse, 1974) .
Chez les Acacia africains on distingue deux grands groupes en fonction du type d'inflorescence
- le groupe d'espèces à inflorescence en épi :_A. albida, A. ataxacantha, A. dudgeoni, A.
laeta , A. macrostachya , A. polyacantha et A. senegal
-- le groupe d~espèces à inflorescence glomérulaire
- réunie en faisceau : A. ehrenbergiana, A. farnesiana, A. gerrrardii, A.
hockii, A. kirkil~ A. nilotica, A. seyal, A. sieberriana, A. tortilis subsp raddiana
- réunie en grappe: A. macrothyrsa , A. pennata
La présence d'épines stipulaires est trés souvent associée à la forme en glomérule de
l'inflorescence; de la même manière la présence d'aiguillons recourbés s'accompagne d'une
inflorescence en forme d'épi. Cependant il existe des exceptions; c'est le cas notamment de
l'espèce Acacia albida qui présente des épines stipulaires et une inflorescence en forme d'épi
et d'Acacia pennata qui possède des aiguillons alors que l'inflorescence est en forme de
glomérule
(Nongonierma, 1978).
Le genre Acacia offre une grande variabilité dans la morphologie et la coloration des pièces
florales (sépales, pétales, anthères, bractées), du nombre de fleurs produites par
inflorescence, de la longueur du style, du nombre d'anthères et d'ovules (Kenrick et
Knox,1985).
3 ) L'ANDROCEE
Les anthères sont situées à l'extrêmité d'un filament et sont constituées de deux lobes
contenant quatre loculi situés deux par deux et l'une au dessus de l'autre.
La présence d'une glande à l'extrêmité de l'anthère est trés fréquente chez les différentes
espèces d'Acacia à l'exception de quelques espèces dont A. albida alors que chez les espèces
australiennes cette glande est pratiquement absente sauf chez A. auriculiformis (
Dnyansagar, 1958) et A. bidwii ( Kenrick et Knox, 1982) .
Le nombre d'anthères est un caractère important dans la stratégie reproductive de
l'espèce; en effet il est apparu (Kenrick et Knox, 1989) que si le nombre de fleurs formées
au cours d'une saison reproductive est génétiquement déterminé, le nombre d'anthères est

27
variable pour une espèce donnée et ce nombre rend compte de l'investissement mâle consenti
par la plante afin d'assurer sa reproduction.
Un autre facteur indicateur de l'effort mâle fourni par la plante est le nombre de
grains de pollen.
Chez les Acacia les grains de pollen appellés monades sont agrégés pour former une polyade
unique qui constitue l'unité de pollinisation. Le polyade est considéré comme l'analogue de la
pollinie des Orchidées épidendroïdes -vandroïdes et de la polyade de certaines Asclépiadacées
dans la mesure où le pollen est émis sous la forme d'une unité composée de grains de pollen
pour faciliter le transport par les insectes vecteurs (Knox et Kenrick, 1982 ; Bernhardt et
al., 1984). La présence de polyades est ainsi considérée comme un avantage sélectif au
moment de la reproduction puisqu'elle confére à l'espèce un moyen de transport trés efficace.
La polyade constitue le produit final de la sporogénèse élaborée au sein de la loge pollinique;
la posjtion respective des monades au niveau de la polyade renseigne sur sa filiation au
moment de la méiose.
Chez les Acacia, le nombre de monades par polyade varie de 8, 12, 16 ; chez Acacia albida ,
Guinet (1969) a dénombré 30 monades bien que Pedley (1978-1979) dans sa
classification citée par Kenrick et Knox, (1 989) dénombre 32 monades.
Dans le souci de clarifier la position taxonomique et phylétique des différents taxa,
Guinet (1 969) a établi une classification des différentes espèces d'Acacia en trois grands
groupes selon leur type pollinique:
- 1) les espèces présentant 4 rarement 3 pores distaux soit les Filicinées et les
,
Vulgares dont A albida se rapproche le plus; mais A albida en est exclue à cause de son éxine
aréolée et rugulée comme chez la tribu des Ingeae, de la présence de polyades de grande taille
composées de 16 à 30 monades avec une éxine à columelle. Parmi les espèces de ce groupe
on distingue A lenticularis , A coulteri , A cathariniensis et A boliviana .
2) Les espèces d'Acacia à 4 pores et 4 sillons distaux soit les A. d'Australie,
Botryocephalae, Pulchellae et Phyllodinae ; notons que les sillons sont de profondes
dépressions à la surface des monades empreintes des cellules de la paroi de l'anthère.
3) Les Acacia à trois pores distaux et le plus souvent à 3 sillons soit les Gummiferae
(A seyal,A raddiana, A nilotica, A giraffae et A hindsii) .
Le tableau 1 montre qu'il existe une étroite corrélation entre le nombre de polyades
et le maximum de graines obtenues à l'intérieur d'une gousse. Le maximum de graines
n'excède pas le nombre de monades par polyade.
4) Le GYNECEE
Le nombre d'ovules est trés variable se situant entre 8 et 16 pour la plupart des
espèces du genre et culminant à 22 chez A albida (Guinet 1969, Kenrick et Knox, 1982 a) .

Tab!. N° 1: Relations entre le nombre de monades par polyade et la formation des graines
chez
quelques espèces d'Acacia selon la classification de Pedley (1978-1979)
Tiré de Kenrick et Knox 1989
Nom d'espèce
Nbre monade/
Nbre maxim
Ratio
polyade
(1 )
graines/ gousse
(1 )/(2)
(2)
A. a/bida
32
21
1.5
A. ataxacantha
16
8
2.0
A. borleae
16
8
2.0
A. burkeii
16
5
3.2
A. caffra
16
10
1.6
A. davyi
16
12
1.3
A. eri%ba
32
24
1.3
A. exuvialis
16
7
2.3
A. famesiana
8
16
32
1 1
0.7 -2.9
A. gerrardii
16
10
1.6
A. grandicomuta
16
12
1.3
A. haematoxy/on
16
14
1.1
A. hebec/ada
16
15
1.1
A. hereroensis
16
8
2.0
A. mellifera
16
5
3.2
A. nebrownii
16
6
2.7
A. nigrescens
16
6
2,7
A. nilotica
16
15
1.1
A. pennata
16
16
1.0
A. permixta
16
6
2.7
A. rehmanniana
16
11
1.5
A. senega/
16
6
2.7
A. swazica
16
10
1.6
A. tortilis
16
14
1.3
A. xanthoph/oea
16
9
1.7

28
La longueur du style est aussi variable d'une espèce à l'autre et dépend de la nature du
vecteur pollinique (Nongonierma, 1978 ; Kenrick et Knox, 1989) .
Selon Heslop-Harrison (1975), les stigmates des Mimosacées sont classés dans le groupe
des stigmates humides et non papillées.
5)
REPRODUCTION
@Phases mâle et femelle
Si la plupart des espèces d'Acacia sahéliens présentent des fleurs hermaphrodites,
(Tybirk, 1989) par contre, chez la grande majorité des espèces australiennes d'Acacia, il
éxiste deux phases mâle et femelle bien séparées dans le temps, la phase femelle survenant
aprés la. phase mâle.
Il a aussi été observé une spécialisation des fleurs différemment situées au niveau de
l'inflorescence certaines sont spécifiquement mâles alors que les autres sont femelles; c'est
le cas chez A. suaveolens (Morrison, 1986) où 17 à 50 % sont mâles ; chez A. karoo les
fleurs hermaphrodites sont distales (Gordon- Gray et Ward, 1975) ,
Chez A. retinodes, les différentes phases mâle et femelle ont été particulièrement bien
étudiées, en particulier, au moment de la pollinisation, la réceptivité du stigmate
caractéristique d'une phase femelle est remarquable par l'exsudation d'un liquide constitué
d'un mélange de protéines, sucres, lipides et composés phénoliques (Knox et al.,1 989 ) et
par une intense activité estérasique (Kenrick et Knox, 1981 a) . Cette exsudation observée
chez les espèces australiennes d'Acacia (retinodes et genistifolia ) a lieu lors des
croisements inter-spécifiques et inter-génériques ; elle est considérée comme un signal de
pollinisation qui assure un milieu adéquat d'hydratation puis de germination (Kenrick et
Knox, 1981),
En dehors de l'exsudation stigmatique caractéristique de la phase femelle, la réceptivité des
pistils déterminée par le taux de formation de graines,
est maximale au cours de cette
période femelle.
Chez A. retinodes, d'autres critères cytologiques ont été observés au cours de la succession
des phases femelle et mâle, La paroi des cellules stigmatiques est trés indentée ; ces
indentations sont supposées jouer un role dans le transport des composés exsudés ou bien
permettraient d'accroître la surface de secrétion (Kenrick et Knox,1 989); par contre, au
cours de la phase mâle subséquente, les cellules stigmatiques perdent l'intégrité de leur
membrane qui était bien nette lors de la précedente phase femelle (Knox et al" 1989), ce
qui suggére une absence totale de viabilité de ces cellules.
Chez les Acacia africains, il n'a pas été observé de phases mâle et femelle bien
differenciées ; l'ouverture des fleurs est pratiquement synchrone chez les espèces à._

29
glomérule avec un certain taux de stérilité femelle alors que chez les espèces a epi
inflorescenciel, l'ouverture s'étale sur 2 à 3 jours (Tybirk, 1989) ; on retrouve la même
séparation entre espèces à inflorescences en épi et à glomérule au niveau de la séquence
d'ouverture des fleurs: les espèces à inflorescence en épi (albida, senegal, ataxacantha,
polyacantha) ont une ouverture étalée sur 2 à 3 jours alors que les espèces à glomérule
(tortilis,
seyal et nilotica ) présentent une ouverture synchrone durant la nuit
(Tybirk,1989).
Chez A. tortilis qui présente une inflorescence en glomérule, l'expression mâle est accrûe au
niveau des fleurs proximales où les ovaires sont absents alors que les fleurs distales sont
totalement hermaphrodites (Tybirk 1989).
La position et le pourcentage de fleurs hermaphrodites au niveau des inflorescences
glomérlJlaires ou en épi sont caractéristiques de l'investissement femelle consenti par la
plante au cours d'une phase reproductive donnée (Bawa et Webb, 1985). 1\\ est apparu
clairement que pour des raisons d'économie d'énergie, la plante réduit l'investissement
femelle au niveau des zones de l'inflorescence qui sont inaccessibles par les insectes vecteurs
(Tybirk,
1990).
Le nombre d'ovules par ovaire est fortement correlé au nombre de monades par polyade. Le
ratio polyade sur ovule varie pour les Acacia australiens entre 0,8 pour A. paradoxa et 4
chez A. baueri et entre 0,7 (A. farnesiana ) et 3,2 (A. burkeit) pour les espèces africaines·
et asiatiques (Coetzee, 1955; Guinet 1969; Naraschimhasar, 1948 ).
@ Vecteurs de pollinisation
Les principaux vecteurs de pollinisation chez les Acaciae, sont les insectes
Hymenoptères Diptères et Coléoptères (Sedgley et aL, 1992; Tybirk, 1989); cependant la
pollinisation peut s'effectuer par l'intermédiaire des
oiseaux (Kenrick et aL, 1987;
Vanstone et Paton, 1988) et des chauve-souris (Arroyo 1981; Knox et Kenrick, 1983).
@ Qualité et viabilité du pollen
La qualité et la viabilité du pollen d'Acacia varient considérablement (Kenrick et
Knox, 1989). Chez A. retinodes une fois que le pollen se trouve hors des loges de l'anthère sa
viabilité est trés courte. Au moment de l'anthèse, la viabilité déterminée par le taux de
germination, est de 70% mais peut atteindre 90 % (Kenrick et Knox, 1989), par la suite,
le taux de germination chute brutalement à 49% puis à 9% à la suite de traitement à la
chaleur (données non publiées).

30
Chez A. mangium, le pollen perd rapidement son pouvoir germinatif au bout de 3 jours
lorsqu'il est maintenu désseché et à 20·C. Il peut être conservé à s·C pendant 24 heures
seulement. Chez A. auriculiformis, le pollen n'ayant pas subi de traitement perd tout pouvoir
de germer au bout de 6 jours alors que conservé au froid, sa capacité de germer est
maintenue pratiquement inaltérée pendant 11 mois (Sedgley et al., 1992).
5) AUTO-INCOMPATIBILITE
- Déterminisme
L'auto-incompatibilité constitue un système de reconnaissance entre plantes puisque
l'auto-pollen est rejeté alors que l'allo-pollen est accepté. Cette reconnaissance est sous le
contrô.le d'un complexe génique situé à différents loci et présentant de nombreux allèles (De
Nettancourt,1977).
On distingue deux systèmes d'auto-incompatibilité :
- le système d'auto-incompatibilité sporophytique (SSI) : il est déterminé par le
génotype diploïde du sporophyte; il intervient trés tôt à la surface du stigmate et inhibe
l'émission du tube pollinique. A ce niveau, les protéines impliquées dans la reconnaissance
des partenaires sont localisées dans le manteau pollinique d'origine tapétale et à la surface du
stigmate (Heslop-Harrison, 1975
).
La paroi de la portion terminale du tube pollinique présente une accumulation d'une
substance, la callose formant un bouchon; de même au niveau de la paroi des cellules du
stigmate et du style, il se forme des masses de callose.
Ce type a été décrit actuellement au niveau de 6 familles (Charlesworth, 1988)
- le système d'auto-incompatibilité gamétophytique (GSI) : il est sous contrôle
génotypique haploïde du pollen. C'est le système le plus fréquent. Le mécanisme de rejet se
produit au niveau du style et à différentes profondeurs de pénétration en direction de l'ovule.
Dans les deux systèmes (SSI et GSI), le pistil produit des glycoprotéines.
- Auto-incompatibilité chez les Acacia
La plupart des espèces africaines et australiennes d'Acacia possédent ou sont
suspectées d'avoir un système d'auto-incompatibilité qui favorise l'allogamie (Ibrahim
1991). Chez les espèces australiennes 3 espèces présentent une allogamie stricte (A.
mearnsii, A. picnacantha et A. retinodes) ; 3 autres espèces présentent un système d'auto-
incompatibilité partiel (A. myrtifolia, A. paradoxa et A. terminalis) alors que A. ulicifolia
est auto-compatible (Kenrick et Knox,1989).
Chez A. tortilis, Tybirk en 1993 a démontré qu'il existe une auto-incompatibilité partielle
puisque seul 0,3% des épis autopollinisés ont fructifié.

31
Les études cytologiques pour déterminer la zone où s'arrête le tube pollinique dans le cas
d'une auto-fécondation chez A. retinodes espèce auto-incompatible, ont montré que le tube
pollinique pénètre les tissus stylaires et migre jusqu'au niveau du nucelle où il s'arrête
(Kenrick et Knox, 1985) ; il apparait ainsi que le modéle d'auto-incompatibilité observé
chez cette espèce est de type "gamétophytique associé à un systeme génique post-zygotique
léthal ou sub-Iéthal" (Kenrick et Knox, 1989).
C) MICROPROPAGATION VÉGÉTATIVE DES ARBRES
La mul.tiplication végétative est basée sur la possibilité pour un végétal donné, à partir de
fragments d'individus (tige feuille ou racine, tissu ou cellule... ), de reconstituer un ou
plusieurs individus sans intervention d'un processus sexué.
Le terme multiplication englobe non seulement la notion d'arithmétique qui permet
de passer du simple au multiple mais aussi une notion de maintien du patrimoine génétique
qui est copié de façon plus ou moins exacte au niveau des clones obtenus.
L'aptitude à la multiplication est considérée comme une potentialité fondamentale des
végétaux et elle a été largement utilisée en arboriculture fruitière et en horticulture.
En amélioration génétique, la propagation végétative constitue un des piliers des
programmes de recherche pour une production en masse de plants forestiers; en effet elle
présente de nombreux avantages par rapport à la propagation par voie sexuée.
Les principaux avantages sont les suivants:
1) les arbres possédent des cycles de reproduction particulièrement longs; en effet,
pour passer d'une génération à une autre il faut attendre en moyenne 10 ans pour pouvoir
observer le résultat des croisements effectués; alors qu'avec le clonage, l'effet des schémas
d'amélioration est observable dans un délai relativement court.
2) l'uniformité génétique des clones produits est aussi un des avantages non moins
importants. L'homogénéité est un facteur recherché lorsqu'on veut fixer un caractère; mais
elle présente aussi des inconvénients puisqu'elle diminue la base génétique.
Bien que cette uniformité soit discutable en raison des variations liées à la position de
l'expiant de départ sur l'arbre (topophysie) ( Boulay,1979 ; Cornu et Chaix, 1981;
Franclet et al., 1987) et à l'environnement nutritionnel prévalant au moment de l'éxcision
de l'expiant primaire (Leakey et al., 1992),
la variabilité intraclonale observée est
généralement beaucoup moindre que celle des clones issus d'individus différents.

32
3) Il a été démontré chez certaines espèces dont le peuplier (Shields et Bockheim,
1981), le séquoia (Franclet,1 989) et le cryptomère (Isikawa, 1987) que la croissance
initiale des clones issus de propagation végétative, est améliorée par rapport à celle d'un
semis.
4) En clonant des arbres adultes pour des caractères qui s'expriment à l'âge de
maturité (ex fruits graines ), il est possible d'occulter le stade juvénile et obtenir au bout
d'une durée relativement courte, des arbres
arrivés à maturité et qui sont productifs
(Hackett et Murray, 1992).
5) en clonant des arbres-élites, des hybrides interspécifiques ou bien des individus
sélecti.onnés au sein d'une population naturelle, on favorise la transmission des caractères
génétiques désirables aux clones pratiquement sans altération.
Ceci permet de conserver les combinaisons génétiques exceptionnelles qui auraient été
perdues dans le cas d'une reproduction sexuée.
G) certains hybrides issus de croisements entre parents trés éloignés sont
généralement stériles seule la propagation végétative permet de capturer le gain génétique
obtenu en conservant les hybrides et en les multipliant (ex: Pinus rigida x taeda (Gassama,
1984); (Eucalyptus urophylla x grandis ( Viera et al., 1992).
La multiplication végétative présente des avantages mais aussi des inconvénients.
Les problémes liés au clonage sont exacerbés du fait de la multiplication à grande échelle.
1 ) il s'est avéré nécessaire d'effectuer des tests multilocaux sous différents types de
climats en vue de définir leur limites d'adaptation. Certains clones sont trés sensibles aux
pathogénes et aux ravageurs.
2) Chez certains clones, au fil des générations de clonage, il arrive de constater un
phénomène de "dégénerescence c1onale"; ce phénomène a été attribué à l'accumulation de
pathogénes et de virus en particulier; par exemple un clone extrêmement productif de
pommier a été propagé pendant 500 à GOa ans en Europe de l'Est ; ce clone a
progressivement disparu en raison d'une succession de facteurs dégénerescents
(Bonga,1 981).
Pour contourner le problème lié à l'étroitesse de la base génétique, et pour obtenir une plus
grande stabilité écologique, il a été recommandé pour le reboisement, de mettre en place des
stratégies de mélanges de clones plutôt qu'un seul clone, même s'jl est tres performant.

33
En dehors des problèmes liés à la degénérescence clonale, il subsiste d'autres
problèmes liés aux méthodes traditionnelles de propagation végétative, en particulier
lorqu'on utilise du matériel adulte.
Le greffage est une méthode traditionnelle largement utilisée mais il nécessite une
importante main d'oeuvre et est onéreux; de plus l'incompatibilté de greffage constitue un
sérieux problème surtout lorsque le rejet ne survient que plusieurs années plus tard.
Le
bouturage est une méthode plus efficace et moins onéreuse; il a été utilisé pour cloner et
reboiser de trés grandes surperficies (ex les hybrides d'Eucalyptus ont été bouturés et
utilisés pour un reboisement à grande échelle au Congo (Martin et Quillet,1974) ; des
boutures de Casuarina equiesetifolia ont servi de matériel de base pour reboiser plusieurs
hectares de dunes maritimes (Sougoufara et al., 1989).
.Cependant le faible taux d'enracinement des ortets adultes, le phénomène de
plagiotropisme persistant ainsi que la faiblesse de la croissance des boutures limitent son
utilisation.
La culture de tissus "in vitro" constitue une nouvelle approche développée depuis une
trentaine d'années permettant de surmonter ou à la limite de réduire les problémes liés à
l'utilisation de ces techniques traditionnelles.
La culture "in vitro" a déja trouvé un large champ d'application chez les plantes
annuelles et horticoles présentant une valeur ajoutée certaine. Par contre chez les arbres
forestiers, les méthodes "in vitro" n'ont pas trouvé un champ d'application aussi large parce
que les espèces forestières utilisées ne sont pas toujours commercialisables d'une part et
d'autre part parce qu'elles sont beaucoup plus récalcitrantes à la regénération "in vitro".
1- M ICROPROPAGATION
À
PARTIR
DE
TISSUS
ADULTES
L'utilisation chez les essences forestières de jeunes semis pourrait constituer un matériel
idéal s'il était possible de prédire par des marqueurs biochimiques, génétiques et
moléculaires, les performances à l'âge adulte des individus. En l'absence de ces critères,
seules les données de base sur la juvénilité la maturation le rajeunissement peuvent étre
utilisées.
1- 1) Concept de juvénilité et de maturation
Les potentialités de clonage d'un individu donné sont étroitement associées aux facteurs
génétiques et physiologiques qui contrôlent le passage de la phase juvénile à la phase adulte
(Songa 1982, Franclet 1982, Hackett 1985).
Si on ne peut pas nier le phénomène du vieilliissement ontogénétique irréversible et
génétiquement programmé pour rendre compte de la perte progressive des potentialités
organogènes, il est apparu tout ausi clair que les méristèmes d'un arbre ne sont pas tous au

34
même stade de maturation. En effet, il a été constaté que certains méristèmes prélevés à la
base du tronc sont plus "jeunes" que ceux prélevés au niveau de la cime de l'arbre.
L'état de juvénilité ou de maturation chez un arbre donné dépend de plusieurs facteurs:
-A) Le nombre de divisions mitotiques intervenues depuis la formation du
méristème ; plus les divisions sont nombreuses et plus le méristème accumule des signaux
de corrélations qui stabilisent l'information génétique pour l'orienter vers un type
organisationnel correspondant à l'âge réél (Franclet 1982; Demarly 1985).
Les méristèmes quiescents d'attente se trouvent poussés en avant des initiales actives
sans subir pratiquement de divisions mitotiques; ce sont ces méristèmes qui sont mis à
contribution au moment de la formation des fleurs. En effet on a souvent souligné (Holliday et
Pugh, 1975) le fait qu'au niveau des arbres adultes seules les lignées cellulaires entrant en
méiose sont capables de conserver leur pouvoir organogéne.
C'est ainsi que des inflorescences immatures ont été utilisées pour produire des
bourgeons végétatifs "in vitro" chez le palmier, (Reynolds 1982 ), chez Casuarina
equisetifolia ( Duhoux et al., 1986). De même, les pédoncules de cones femelles immatures
de Larix decidua sont capables de produire de multiples pousses adventives lorsqu'ils sont
prélevés à une époque proche de la méiose (Chalupa, 1987).
Il existe aussi d'autres parties de la fleur ayant un potentiel élevé de regénération chez les
arbres adultes: il s'agit du nucelle de l'ovaire et de l'ovule des Citrus, le nucelle du manguier
du pommier et du raisin (Mullins et Srinivasan, 1976). En dehors des tissus diploides
sporophytiques, des cellules gamétophytiques haploïdes (Bonga 1982) et des cellules de
l'endosperme (Lakhsmi Sita et al., 1980) se sont révélées capables de morphogénése "in
vitro". Il faut cependant noter que ces méthodes ne sont envisageables dans le cadre d'une
micropropagation que si le taux de variation observé est acceptable.
D'aprés ces constatations,il s'avère qu'il est possible de rajeunir des tissus végétaux à
condition de pouvoir trier au sein du végétal les territoires cellules ou tissus ayant conservé
leur potentiel juvénile.
-B)
L'environnement immédiat hormonal et nutritionnel des cellules
méristématiques : il a été démontré que des substances hormonales (acide abcissique,
cytokinine) et la nutrition minérale peuvent influencer l'état de juvénilité ou de maturation
des territoires organogénes ; en effet, ces substances sont capables de mettre en place des
circuits de corrélations activatrices ou inhibitrices induisant au niveau cellulaire un
phénomène d'anergie. La conséquence est qu'une bouture issue d'un matériel ayant subi des
manipulations (ex: recépages, pulvérisations de cytokinine, apport en quantité suffisante
d'éléments minéraux nutritifs), présentera une croissance de type juvénile par rapport à
une bouture n'ayant pas subi de manipulation.

35
Les drageons prélevés à proximité du système -racinaire, bénéficient d'un environnement
favorable caractérisé par une teneur des tissus en cytokinine plus élevée, une alimentation
minérale et hydrique plus importante que dans la cime; il a été constaté que ces drageons
conservent des potentialités organogénes plus importantes que les autres parties de l'arbre.
Chez Pinus pinaster (Franclet et al., 1987) agé de 11 ans, la regénération a été effectuée à
partir de brachyblastes ; cependant l'effet rejuvénilisant n'a été maintenu qu'au prix d'un
traitement nutritionnel et environnemental optimal pour éviter le retour à un stade
physiologique mature.
L'importance du réseau de corrélations inhibitrices sur les territoires méristématiques âgés
a été demontré par Tran than
Van (1980) ; en effet il a montré que les potentialités
morphogénes sont souvent stimulées ou inhibées par les tissus voisins. Par conséquent il
n'est pas seulement nécessaire de localiser les cellules ou tissus susceptibles de répondre à
la stimulation organogéne, mais il faut les isoler des tissus inhibiteurs voisins.
La miniaturisation de l'expiant prend ainsi toute son importance dans la mesure où si
on prend le cas extrême d'une cellule méristématique qui a conservé toutes ses potentialités
morphogénes, il est plus facile à partir de cette cellule de reconstituer intégralement des
individus que lorsqu'il s'agit d'un groupe de tissus ou d'organes différenciés et spécifiques
dans leur fonctionnement. C'est ainsi qu'on arrive à former des embryons somatiques à
partir de cellules simples ou à fusionner des cellules issues d'espèces ou de genre differents ;
le seul inconvénient est que lorsqu'on aboutit à une regénération, les individus obtenus ne
sont pas toujours conformes à l'individu d'origine.
1-2) Changements métaboliques liés à la maturation
Lorsqu'on veut régénérer des plantules à partir d'un expiant primaire, on cherche à
engager le processus métabolique vers une nouvelle direction en changeant par exemple les
rapports cytokinine/auxine, acide abcissique/auxine, nitrate/ammmonium, ainsi que de
nombreux éléments minéraux tels que le K+ le CA2+ le Mg 2+. Cependant il éxiste d'autres
moyens de modifier le processus métabolique au niveau tissulaire susceptibles de conduire à
une morphogénése.
Des travaux ont été effectués sur les principales voies métaboliques au moment de
l'embryogénèse (Durzan, 1992 ) et sur le rajeunissement (Holliday et al., 1975 ; Meins et
Binns, 1978). Les voies métaboliques de la respiration, un phénomène étroitement lié à la
morphogénèse, ont été souvent utilisées pour orienter la réponse morphogéne in vitro.

36
L'utilisation de stimulateurs et d'inhibiteurs métaboliques spécifiques permet
d'orienter le métabolisme de certains lignées cellulaires récalcitrantes vers la voie que l'on
a choisie.
Il a été constaté que lors de la regénération de pousses à partir de cals, la voie pentose
-phosphate est privilégiée par rappport à la voie glycolytique. La stimulation de la voie
pentose-phosphate par utilisation de l'acide malonique (Bonga, 1981) et l'inhibition de la
voie glycolytique par l'acide hydroxamique salycilique (SHAM) (Siedow et Girvin,1980)
aboutissent à une exacerbation de la morphogénèse.
Les substances de croissance jouent aussi un rôle dans le métabolisme respiratoire.
Le 2-4D est une auxine capable de détourner le glucose dégradé de la voie glycolytique vers
la voiè pentose-phosphate (Black et Humphrey, 1962). La cytokinine bloque la voie
alternative, la benzyl adénine stimule la cytochrome-oxydase et inhibe les glycolytique-
kinases. Il a aussi été démontré que l'éthylène qui est un puissant inhibiteur de la
morphogénèse stimule les voies alternatives.
Avec l'âge ontogénétique, les potentialités morphogénétiques sont progressivement
réprimées. La maturation est un processus complexe entraînant des modifications aussi bien
au niveau du noyau, du cytoplasme et des organites cellulaires. Cependant, au moment de la
méiose il se produit une réversion de l'âge ontogénétique impliquant le cytoplasme
(mitochondries et plastes) et l'ADN nucléaire (Holliday et Pugh,1975).
En effet, il a été constaté qu'au cours de la sporogénèse, et en particulier au moment
de la méiose et de la formation de la tétrade, une grande quantité d'ARN messager et d'ARN
ribosomal est détruit au niveau des cellules (Dickinson,1982). D'autre part, les organites
cellulaires (mitochondries et plastes) se dé-différencient et une importante quantité de ces
organites cellulaires est éliminée.
Selon l'hypothése émise par Dickinson (1982), ces phénomènes résulteraient sûrement de
l'éradication d'une forte proportion de molécules porteuses d'une information "sporophytique
". Ainsi avec l'élimination de la surcharge
de la cellule et
de l'information génétique
(Franclet, 1981; Demarly, 1985), les cellules acquièrent de nouveau un état proche de
l'état initial embryonnaire.
Il a aussi été constaté qu'au cours des divisions asymétriques, la répartition de
population mitochondriale n'est pas la même dans les deux cellules-filles; cette inégalité de
répartition de populations mitochondriales pourrait être à l'origine de différences de degré
de juvénilité constaté au niveau des méristèmes d'un arbre (Dickinson,1982).
Au niveau du noyau, il existe des mécanismes susceptibles d'induire des changements
semi-permanents dans le développement de la cellule. Parmi ces mécanismes, le plus
important est la méthylation de l'ADN (Holliday et Pugh,1975); d'autres phénomènes

37
peuvent intervenir tels que les transposons, les inversions de séquence, des amplifications
de séquences susceptibles d'étre éliminés plus tard.
Ces différentes considérations montrent à quel point les mécanismes qui soutendent
la maturation ont été activement recherchés et incomplétement élucidés.
Tout récemment et grâce aux progrés de la biologie moléculaire, l'état adulte chez
Hedera helix a pu être caractérisé de façon trés fine (Hackett et al., 1992); en effet les
jeunes feuilles accumulent au niveau du mésophylle
des pigments anthocyaniques,
phénomène absent sur les feuilles âgées. En utilisant les banques d'ADNc, les auteurs ont pu
caractériser l'état adulte par l'absence d'ARNm du géne codant pour un enzyme la DFR
(Dihydroflavonol reductase) ; en isolant le géne codant pour l'enzyme, il sera possible par
hybridation "in situ", de localiser les sites de changement de compétence pour la biosynthèse
des anthocyanes et comprendre la dynamique du processus de maturation.
Le rajeunissement demeure à l'heure actuelle un sujet encore trés controversé; pour
de nombreuse espèces d'Angiospermes, le phénomène du rajeunissement est bien réel, alors
que chez les Gymnospermes à part quelques Taxodiacées, le rajeunissement est encore
considéré comme un artéfact et trés souvent à la suite de nombreuses sub-cultures qui font
réapparaître des caractères juvéniles, les caractères matures ressurgissent au cours de la
phase d'acclimatation (Franclet et Franclet-Mirvaux, 1992) .
Ainsi certains auteurs (Roberts, 1979) attribuent ces changements à un effet
"revigorant" ponctuel plutôt qu'à un changement profond affectant le contrôle génétique du
développement des méristèmes.
Cependant, compte tenu de la difficulté de trouver des marqueurs fiables de
juvénilité, de la complexité du phénomène de la maturation et de la difficulté de dissocier la
cause de l'effet observé sur la plante, peu de progrés ont été réalisés dans ce domaine. De
plus en plus les chercheurs tendent à utiliser l'outil de la biologie moléculaire
(Durzan,1992 ; Greenwood,1992; Hackett, 1992) en espérant arriver à comprendre de
manière précise la succession des événements aboutissant à la maturation.
2- EMBRYOGÉNESE
SOMATIQUE
Les faibles taux de multiplication et les coûts élevés de production des vitroplants
constituent de sérieux problèmes lorsqu'on veut micropropager à grande échelle.
Il existe généralement deux méthodes de micropropagation : la première utilise la
voie de la caulogénèse suivie d'une rhizogénèse, la deuxième utilise la voie de l'embryogénèse
somatique avec la formation d'embryons organisés à l'intérieur d'un tissu callogène (Vasil et
Vasil 1972).

38
La micropropagation par la voie de l'embryogénèse somatique demeure un des moyens
les plus intéressants pour accroître le potentiel de multiplication donale.
L'embryogénèse somatique offre un avantage significatif pour une production intensive
rapide et à grande échelle de plants forestiers ( un cal d' Hevea braesiliensis de 3 cm de
diamètre peut contenir environ 3000 à 4000 embryoïdes (Carron et aL, 1984».
L'embryogénèse somatique est d'autre part considérée par de nombreux chercheurs comme
une méthode peu onéreuse pour produire des micropropagules en raison du nombre infini
d'embryons produits mais aussi de la possibilité d'automatiser les différentes étapes de la
formation des embryons somatiques.
Elle a été décrite chez de nombreuses espèces herbacées (le soja) et surtout chez des
espèces céréalières telles que le maïs, le triticale, le riz etc... mais peu d'études ont été
effectuées sur les ligneux forestiers (Garyal et Maheswari, 1981 ». La production de
différentes espèces telles que l'hévea ( Carron et aL, 1984), le palmier à huile (Hanower et
Hanower, 1984), le palmier dattier ( Tisserat et de Mason, 1980), le cocotier (Abraham et
Thomas, 1962 ; Panetier et Buffard- Morel, 1982), le caféier
(Starisky, 1970 ; Dublin
1984 ; Sondhal et aL, 1978; Yasuda et aL, 1985); le cacaoyer (Janick, 1986; Kononowicz et
Janick, 1984a ; Kononowicz et Janick,1 984b) ; Sismmondsia chinensis ( Wang et Janick,
1986), qui sont des espèces à intérêt économique
est actuellement
basée sur
l'embryogénèse somatique.
Ce procédé en plus des avantages inhérents à la réduction des coûts de production,
devrait permettre d'obtenir des propagules totalement rajeunis ; en effet,
la dé-
differenciation des cellules matures qui permet l'expression des potentialités embryogènes
donc un retour à la totipotence, a pour conséquence un rajeunissement complet des cellules.
Au cours de l'embryogénèse une structure embryoide bipolaire (possédant
simultanément un pôle de tige et un pôle de racine) est formée et est prête à germer.
La procédure habituelle éxige l'induction d'un cal à partir d'un expiant adéquat. Les
tissus de l'embryon immature ont été trés souvent utilisés (nucelle de citrus (Ranganwan,
1981);
embryons zygotiques immatures, (Weng et Janick, 1986 ; Heyser et aL, 1983;
Vasil et Vasil, 1981; ovule (Starisky,1 970; Kamo et aL, 1985). De jeunes inflorescences
et des fragments de racines de Bambusa sp. (Yeh et Chang, 1986 ) ont été utilisés comme
explants initiaux pour induire une embryogénèse "in vitro". Des sections d'hypocotyles (
Arriligia et aL, 1986 ; Miroslava et aL, 1984) ainsi que des feuilles ( A. Pal et aL, 1985 ;
Wernicke et aL, 1981 ; Sondhal et aL, 1977 ; Dublin, 1981 ; Yasuda et aL, 1985) se sont
révélés être un matériel de choix pour une optimisation de l'induction et le développement
embryogéne.

39
Il est souvent apparu que même pour des lignées difficiles à regénérer, on peut
obtenir des cellules
embryogénes rapidement en choisissant les tissus appropriés
correspondant à une étape particulière du développement. Chez Brassica campestris
(Maheswaran et Williams, 1986) et Trifolium repens (Maheswaran et Williams, 1985), la
réponse embryogéne dépend du stade de développement de l'embryon zygotique dont il dérive
et est limité aux cellules superficielles basales de l'hypocotyle de l'embryon. Le milieu et les
conditions de culture n'ont aucun effet sur l'induction embryogéne. Il apparait ainsi que que
le niveau interne de détermination des cellules, lié à leur position au sein des tissus et à leur
stade ontogénétique, constitue un facteur critique dans l'expression de l'embryogénèse
somatique dés lors que les cellules sont libérées du contrôle exercé par les tissus
environnants.
Ces explants sont
soumis à un traitement auxinique en général du 2-4 D sur un
milieu semi-solide. Le cal obtenu est sub-cultivé soit sur un milieu semi-solide (bambou,
jojoba, Aesculus, Dactylis glomerata) ou transféré en milieu liquide pour obtenir des
suspensions cellulaires
(jojoba).
Le cal ou la suspension cellulaire continue sa croissance en présence des régulateurs
de croissance qui favorisent une abondante callogénèse et une initiation de massifs
méristématiques.
Lorsque la teneur en auxine et en nitrate est réduite ou supprimée du milieu de culture, les
embryoides se différencient.
Les cals embryogénes se distinguent des cals non embryogénes par leurs aspects
morphologiques. En effet, les cals embryogénes sont reconnaissables à la couleur qui est
blanc-crême à jaune pâle, à la surface du cal qui est lisse un peu luisante et surtout à
l'aspect compact du cal contenant des structures ressemblant à des nodules (Yeh et Cheng
,1986).
Ce cal compact et organisé en structures nodulaires, peut
maintenir son potentiel
embryogénétique durant plusieurs mois.
Des coupes histologiques ont permis de déterminer les zones de formation des cellules
embryogénes . Chez Coffea arabica les embryons sont initiés au niveau des zones
superficielles
(Michaux -Ferriere et al., 1987) au niveau des cellules périphériques du
mésophylle (Sondhal et al., 1978) au niveau des cellules épidermiques ou sub-épidermiques
chez le maïs (Vasil et Vasil, 1985) ou au niveau de l'épiderme hypocotylaire chez Trifolium
repens (Maheswaran et Williams, 1985).
Les cellules embryogénes sont reconnaissables par leur petite taille, leur cytoplasme
dense et trés riche en grains d'amidon et une paroi épaisse; elles présentent l'aspect de
cellules méristématiques avec un rapport nucléoplasmique élevé, un nucléole volumineux et
intensément coloré. A côté, les cellules non embryogénes sont généralement de grande taille

40
trés vacuolisées et possèdent une paroi fine et sont pratiquement dépourvues de grains
d'amidon.
Gupta et aL, 1986 ont mis au point une méthode de coloration permettant de
distinguer les cellules embryogénes des cellules non embryogènes chez le genre Pinus.
L'étude histologique de la formation des embryons somatiques chez Coffea arabica a
montré (Michaux-Ferrière et aL, 1987) que l'embryon somatique dérive d'une seule cellule
mais ce phénomène n'est pas généralisable puisqu'il a été montré que les embryons
somatiques peuvent dériver d'un amas constitué de 3 à 4 cellules (Williams et Maheswaran,
1986).
L'AIA s'et révélé être un bon inducteur de l'embryogénèse chez Dactylis glomerata
(Hanning et Conger, 1985 ) alors que chez Triticale (Stolarz et Lorz, 1986), la kinétine est
l'horm()ne responsable de l'induction de l'embryogénèse.
Un stress osmotique s'est révélé favorable sur la formation d'embryons somatiques chez
Carica papaya (Litz, 1986), chez le maïs l'addition de proline s'est avéré déterminante dans
la réponse à la stimulation embryogéne.
L'addition d'acide nicotinique et de thiamine intensifie l'embryogénèse chez Glycine max
(Barwale et aL,1986).
L'irradiation par les rayons gamma stimule l'embryogénèse chez Daucus carota
(Sangwan et Sangwan, 1985) mais les embryons formés sont incapables de germer pour
donner une plantule.
Les polyamines en particulier la putrescine favorisent l'embryogénèse somatique de
cals de Daucus carota (Ferier et aL, 1984 ; Montagüe et aL, 1978).
Le nitrate d'argent stimule l'embryogénèse somatique à partir de tissus de carotte grâce à
une action inhibitrice sur la production d'éthylène ( Roustan et aL,1990).
La regénération par voie de l'embryogénèse somatique a montré une grande
variabilité cytogénétique au niveau des embryons formés (Mc Coy et aL, 1982 ; Karp et
Maddock, 1984) alors que par ailleurs, on note une relative uniformité (Chen et aL, 1981;
Heyser et Nabors, 1982 ; Mc Coy et Philipps, 1982; Hanna et aL, 1984 ; Swedley et Vasil,
1984). Ces études cytogénétiques et la caractérisation par électrophorèse des protéines
totales (Swedlung et Vasil, 1984), ont révélé l'existence d'une forte pression de sélection en
faveur d'une regénération à partir de cellules cytogénétiquement normales.
La suppression progressive des hormones aboutit à la maturation des embryons ; les
embryoides passent en effet par les différentes étapes ontogénétiques qui mènent vers la
formation d'un embryon normalement constitué; ce schéma a été mis en evidence chez de
nombreuses espèces céréalières mais aussi chez le caféier (Michaux -Ferrières (1987);

41
Dublin, (1981) ; Moens 1984 ) ; il existe cependant des exceptions (Lowe et al.,1 985
Barwale et al., 1986) où les différentes étapes n'ont pas été observées.
Chez Acacia koa (Skomen,1 986), la formation des embryoides n'est pas suivie de leur
germination ; en effet en l'absence de stimuli cotylédonnaires indispensables à la
germination, et malgré les différentes modifications de la composition du milieu de culture,
les structures embryoides sont restées bloquées.
Les embryons somatiques de Picea abies peuvent
conserver leur pouvoir de
regénération pendant deux mois lorsqu'ils sont déshydratés; la dessication permet de réduire
la teneur en eau de 85 à 90% ; cette réduction est comparable à celle observée dans les
conditions naturelles sur la graine (Berteche et Reymond,1 992).
3- REGÉNÉRATION PAR CULTURE DE RACINES EXCISÉES
Les premières études effectuées sur la culture de racines avaient pour objectif
essentiel de comprendre la physiologie racinaire, la nutrition la croissance et le
développement.
De nombreux travaux ont permis de définir les conditions de la nutrition et de l'absorption
minérale des racines (Bonner et Devirian,( 1939), White, (1943).
Torrey, (1951, 1965) a mis en évidence les potentialités organogénes des tissus racinaires
qu'il assimile à celles observées sur les tiges.
Des auteurs se seront par la suite intéressés à la culture de racines excisées en vue
de la regénération de plantes entières (Danckwardt-Lillestrom 1957). Ces travaux sont
relativement peu abondants. Généralement, les capacités de regénération des plantes sont
largement étudiées mais peu d'auteurs examinent le comportement des racines "in vitro" ;
cependant il a été démontré (Chaturvedi, Sinha, 1979 ) que les racines de nombreuses
espèces végétales sont extrêmement morphogènes "in vitro" et qu'il est plus rapide de
regénérer des plantes entières à partir de tissus racinaires qu'à partir de tissus aériens.
En 1965, Bonnet et Torrey cultivent des racines de Convolvulus arvensis et
déterminent l'importance des éléments minéraux dans l'expression de la morphogénèse "in
vitro". Charlton (1965) réussit à initier des bourgeons sur des racines excisées de Linaria
vulgaris.
Kato et Takeuchi (1963) induisent une réponse morphogéne à partir de fragments de racines
de carotte.

42
Kefford et Caso (1972) sur Chondrella juncea ont réussi à regénérer des plantes
entières à partir de racines et ont montré l'importance de l'âge de la racine sur les
potentialités organogénes .
Sur Brassica sp. (Lustinec et Horak,1970 ; Bajaj et Nitsch 1975 ; Lazzeri et Dunwell
1984) ont réussi à cultiver des racines appartenant à différentes espèces et cultivars et à
regénérer des pousses adventives.
Chez les arbustes en particulier chez Citrus sinensis (Burger et Hackett 1986) ,
Citrus mitis ( Sim et al., 1989) et Citrus aurantifolia (Bhat et al., 1992) les racines ont
montré qu'elles possèdent d'importantes aptitudes à la regénération "in vitro",
Chez Comptonia peregrina (Gofford et Torrey, 1977), une méthode de propagation a été
mise au point en induisant la formation de bourgeons adventifs à partir des tissus du cortex
racinaire.
Les travaux relatifs à la regénération de bourgeons à partir de racines excisées
d'espèces ligneuses sont trés rares. On peut néanmoins citer les travaux de Brown et Mc
Alpine, 1964 sur le liquidambar, ceux de Mukhopadyay et Mohan Ram, 1981 sur Dalbergia
sissoo et ceux de Allioux 1990 et Phelep et al.,1992 sur Allocasuarina verticillata . Ces
travaux ont permis de mettre au point une méthode de multiplication de ces espèces en
utilisant les racines.
La regénération de tigelles à partir de racines latérales appellée drageonnage est un
phénomène naturel qu'on retrouve chez de nombreuses espéces et constitue une des formes de
propagation dans leur environnement par multiplication végétative asexuée.
La plupart des espèces qui répondent favorablement à la culture de racines excisées, sont des
espèces qui drageonnent naturellement (Bonnet et Torrey 1965 ; Peterson, 1975 ; Mouras
et Lutz 1982) ; cependant des racines d'espèces qui ne drageonnent pas naturellement ont été
amenés à produire "in vitro" des pousses adventives (Allioux 1990, Lazzeri et
Dunwell,1 984) ,
Chez Acacia albida ,la regénération de plantes entières a été obtenue à partir de
drageons développés sur des racines et prélevés sur des arbres adultes ( Gassama et Duhoux,
1986 et 1989). Des essais réussis de bouturage en serre de racines ont été effectués sur de
jeunes plants ( De Fraiture et Nikiema, 1989) et des arbres adultes d'Acacia albida
(Danthu, 1992).

43
D) SYMBIOSE FIXATRICE D'AZOTE ATMOSPHÉRIQUE
La fixation biologique de l'azote atmosphérique est un phénomène qu'on retrouve à des
degrés divers dans la plupart des écosystèmes forestiers. Elle peut être le fait de micro-
organismes libres ou symbiotiques (bactéries, actinomycètes et cyanophycées ). Parmi les
bactéries fixatrices libres on peut citer les genres Azotobacter, Klebsellia et Clostridium, et
chez les cyanobactéries, Anabaena, Calothrix et Nostoc; Azolla est une Ptéridophyte qui
s'associe avec Anabaena; içi la plante développe des cavités au niveau des lobes dorsaux de ses
feuilles au sein desquelles la cyanophycée se reproduit et se developpe ; mais "association
demeure extra-cellulaire. Certaines céréales s'associent avec Azospirillium et échangent des
métabolites sans formation préalable de nouvelles structures.
Par contre lorsqu'il s'agit des arbres associés aux Rhizobium ou Actinomycètes, l'association
est intra-cellulaire et la formation d'un nodule est le résultat d'une vraie coopération
puisque l'association est à bénéfice réciproque.
En fait la symbiose est étroitement tributaire de l'approvisionnement en énergie. Au sein de
"écosystème, les fixateurs libres sont limités par la possibilité
d'accéder rapidement à
l'énergie disponible; ils peuvent cependant utiliser l'énergie contenue dans les exsudats
racinaires mais à ce moment ils devront entrer en compétition avec un grand nombre de
micro-organismes. Les fixateurs libres ne produisent qu'un à cinq Kg d'azote par hectare et
par an (Davey et Wollen, 1979). Cependant leur action ne doit pas être négligée puisqu'ils
agissent sur de trés grandes surfaces et l'activité fixatrice symbiotique au niveau global des
écosystèmes n'est toujours pas entièrement maîtrisée.
On distingue deux grands groupes de végétaux formant une symbiose efficace avec des micro-
organismes fixateurs d'azote:
- les légumineuses: les espèces cultivées dont arachide, niebé, soja pois, luzerne etc
'" , et les espèces arborées Acacia, Prosopis, Leucaena, etc... ) qui s'associent avec une
bactérie du genre Rhizobium (s.l.)
- les non légumineuses ( Casuarina, Alnus, Myrica, etc ... ) qui s'associent avec un
Actynomycète du genre Frankia.
1) FIXATION DE L' AZOTE CHEZ LES LIGNEUX
La dégradation des écosystèmes sahéliens, la demande accrûe en bois de feu et en
fourrage dans les systèmes agroforestiers et agro-sylvo-pastoraux, ont accru l'intérêt porté
par les scientifiques vers les espèces ligneuses capables de restaurer les sols et de pourvoir
aux besoins énergétiques des populations rurales. Les arbres fixateurs d'azote présentent de
nombreux avantages par leur parfaite adaptation aux conditions extrêmes de sécheresse de

44
pauvreté des sols, leur capacité à se développer sur des sols trés pauvres en azote en
utilisant l'azote atmosphérique comme principale source azotée et enfin par la possibilité
qu'ils ont de restituer grâce à la décomposition de la litière, de la matière organique dont
pourra bénéficier la culture annuelle associée.
L'aptitude à fixer l'azote de l'air est un phénomène qui intégre trois composantes essentielles
(la plante-hôte, la souche de Rhizobium et le milieu environnant); la modification d'un seul
de ces facteurs est susceptible d'affecter la fixation.
2) APTITUDE à
FIXER L'AZOTE ATMOSPHéRIQUE
Les q~antités d'azote fixées varient considérablement en fonction de l'espèce, de la souche et
des conditions du milieu naturel. Sesbania rostrata peut fixer entre 498 et 654 Kg d'azote
par hectare et par an (N'Doye et aL, 1992), Casuarina prés de 200 kg (Sougoufara et aL,
1987), Leucaena leucocephala fixe entre 110 et 274 Kg (Hogberg et Kvarnstrôm, 1982)
(Sanginga et al., 1986 et 1988) . Le potentiel fixateur des espèces de Prosopisen zone aride
ou semi-aride, serait compris entre 20 et 40 Kg d'N /Ha jan (Felker 1980).
Prosopis glandulosa est capable de fixer prés de 60% de ses besoins en N, ce qui correspond
à 30Kg d'N /Ha/an (Rundell 1982); Inga junicuil 40Kg/Ha/an (Roskoski, 1981).
Les espèces autraliennes (nodulant avec les souches de Bradyrhizobium), ont une nodulation
trés abondante mais une fixation relativement faible (Cornet et aL, 1985) .
Acacia pennata et Gliricidia sepium fixent respectivement 35 et 13 Kg d'azote/Ha/an
(Roskoski et aL, 1980).
Il est apparu que le potentiel fixateur, considéré comme étant le potentiel absolu ou virtuel
que la plante est capable d'exprimer en dehors de toute contrainte liée à l'environnement, est
tres variable en fonction des espèces et en fonction de la méthode de mesure (Dreyfus et aL,
1988).
Leucaena leucocephala et Acacia mangium ont été identifiées comme étant des espèces à fort
potentiel fixateur (entre 100 et 300 kg d'N par ha et par an).
A l'opposé, Acacia pennata, Gliricidia sepium, Prosopis glandulosa sont des espèces à faible
potentiel fixateur puisque la quantité d'azote fixée dépasse rarement 30kg d'N /Ha jan .
Ainsi les espèces à potentiel élevé se présentent souvent comme des espèces à croissance
rapide et qui tirent une proportion élevée de l'azote dont ils ont besoin à partir de l'azote
atmosphérique, et ceci même en conditions défavorables.
La rapidité de croissance ne constitue pas à elle-seule un trés bon critère de sélection pour
l'aptitude à fixer l'azote. En effet, certaines espèces telles Cassia siamea (actuellement

45
appellée Senna siamea) atteignent des hauteurs trés élevées dés la première année en raison
de la présence d'un système racinaire trés développé colonisant la quasi totalité du substrat
(Danso et aL, 1991). D'un autre côté, un gain de croissance rapide peut être obtenu avec des
espèces trés peu fixatrices lorsque l'azote est remobilisé et absorbé de manière efficace par
les racines.
En effet sur Casuarina equisetifolia, (Sougoufara et aL, 1989) il a été démontré que
l'aptitude à fixer l'azote de l'air est indépendante de l'aptitude à assimiler l'azote du sol; des
clones de Casuarina equisetifolia faiblement fixateurs arrivent à utiliser de manière plus
efficace l'azote du sol que les clones trés bons fixateurs, et par conséquent le rendement de la
transformation en biomasse est plus élevé. Les critères de biomasse végétale, de quantité
d'azote totale contenue dans les tissus de la plante, et de biomasse des nodules constituent de
bons indices en vue de la sélection pour l'aptitude à fixer l'azote.
Ces valeurs apparaissent trés significatives mais elles ne constituent sûrement. pas la
quantité maximale que ces espèces sont capables de fixer; à côté de l'aptitude virtuelle à
fixer l'azote, on distingue le potentiel effectif de fixation qui est quant à lui soumis à de
nombreux facteurs limitants (Dommergues,1987).
3) FACTEURS
SUCEPTIBLES
D'AFFECTER LE
POUVOIR FIXATEUR
D'AZOTE
Tous les facteurs qui participent de façon active au processus de la fixation (Fer, Molybdène,
phosphore assimilable, COZ, lumière, eau Temperature, pH , azote combiné et le sel),
peuvent, lorsqu'ils deviennent Iimitants en affecter l'efficacité (Duhoux et Dommergues,
1986).
La fixation biologique de l'azote nécessite en dehors du phosphore du molybdène du fer et du
magnésium, une certaine quantité d'azote pour former des unités d'acides aminés
indispensables aux protéines enzymatiques.
3-1) l'Azote
Un sol relativement pauvre en azote combiné favorise la nodulation alors que de forts taux
l'inhibent. En effet Sanginga et aL, (1988,1989) sur Leucaena leucocephala et Kang
(1975) sur le soja ont montré que la nodulation (nombre de nodules et poids sec) pouvait
être inhibée en présence d'azote organique. Dazzo et Drill (1978), avaient déja montré que
des quantités importantes d'azote réduisent le nombre de poils absorbants racinaires et par
conséquent la nodulation. Sougoufra et aL, (1990) ont montré l'effet négatif d'un apport
d'engrais minéral azoté sur la fixation biologique de l'azote.

46
L'influence de l'azote combiné a été étudiée chez Aeschynomenae scabra (Eaglesham et
Szabray, 1983) ; chez Sesbania rostrata le taux d'inhibition de la nodulation en présence de
1,SmM de NH4N03 est de 64% pour les nodules caulinaires et de 81 % pour les nodules
racinaires. Cependant Umali et Garcia (1988) et Galiana (1990) sur Acacia mangium, ont
montré que contrairement aux autres espèces, en présence de fortes doses d'engrais azotés
(100 kg d'N /Ha), A. mangium est capable de former de nombreux nodules. Domenach et
Kurdali, (1989) ont démontré que de forts taux d'azote dans le sol n'inhibent pas la capacité
à fixer l'azote atmosphérique chez A/nus g/utinosa.
Les sols tropicaux sont des sols caractérisés par leur pauvreté en azote et en phosphore
assimilable. L'addition d'engrais azotés constitue souvent un préalable à une croissance des
plants. En effet, Leucaena /eucocephala est une espèce qui présente une croissance initiale
particulièrement lente lorsqu'il est cultivé sur un sol déficient en azote; et d'ailleurs, il est
recommandé, pour améliorer sa croissance, d'ajouter un inoculum associé ou non à de
l'engrais (NAS, 1977). Cet azote jouerait le rôle d'azote starter indispensable au bon
développement des plants au cours des premiers mois de croissance. En effet, le processus de
la fixation d'azote ne s'installant pas dés la germination, la plante subit pendant les
premières semaines des carences en azote qui inhibent sa croissance ou qui lui sont parfois
fatales (Sanginga et aL, 1988; 1989).
De même durant la période de formation des nodules, les besoins en azote sont accrus et c'est
à cette période que l'addition de fertilisants est souvent recommandée (Michin et aL, 1981).
3-2) le calcium
Chez les légumineuses tempérées, les besoins en calcium sont relativement importants et
puisque le calcium et le pH interagissent au niveau du sol, à des pH acides, la plante nécessite
plus de calcium pour la nodulation. Les carences en calcium influeraient sur les premiers
stades de la nodulation, au moment de l'initiation de l'infection bactérienne (Munns, 1977 ;
Lie et van Egaraat, 1988).
3-3) l'acidité et la toxicité aluminique ,
L'acidité et son corrollaire la toxicité aluminique, constituent dans bien des cas un facteur
limitant de la nodulation et de la fixation d'azote (Fageria et al.,1988). Les pH acides
inhibent la croissance et la nodulation chez Sesbania rostrata (Furoc et aL, 1985; Ahmad et
Ng,1981)
Leucaena leucocephala présente un faible taux d'établissement sur les sols tropicaux acides
en raison d'une inhibition de la croissance racinaire dûe à la toxicité aluminique (Koffa et
Mori, 1987; Wong et Davendra, 1983) ; selon Hutton (1983) une moins bonne absorption

47
du calcium serait à l'origine de l'intolérance de Leucaena leucocephala sur les sols acides.
Gliricidia sepium inoculé sur sols acides a nodulé mais aucune réponse à l'inoculation
relative à la biomasse produite, n'a été décelée (Osunde et Sanginga, 1989).
Les travaux récents de Lesueur et al., (1992) sur Acacia albida et Acacia mangium, ont
montré que les souches de Bradyrhizobium utilisées sont parfaitement adaptées à l'acidité du
milieu environnant; par contre elles ont montré une nette sensibilité à l'égard de
l'aluminium qui se révèle ainsi être un facteur majeur de sélection de souches de
Bradyrhizobium. Il a aussi montré que les plantes-hôtes présentent une variabilité dans le
degré de tolérance à l'acidité du sol.
3-4) Pathogénes
Parmi tes facteurs limitants de la nodulation et de la fixation d'azote atmosphérique, on a pu
noter la population d'Actynomycètes du sol qui jouerait un role important par son
antagonisme de la croissance des Rhizobium chez Prosopis juliflora et P. africana (Diagne
1993).
3-5) Lumière
La lumière peut jouer un grand rôle dans l'efficacité de la symbiose; en effet une lumière
rouge favorise la nodulation alors que la lumière bleue l'inhibe. Cependant, le rouge lointain
qui est la longueur d'onde la plus courante sous le houppier dans les écosystèmes forestiers
inhibe totalement la nodulation (Lie, 1974) .
4) PROBLEMES
LIÉS
AUX
LIGNEUX
SAHÉLIENS
4-1) Absence de nodulation "in situ"
Une constante retrouvée chez la plupart des ligneux sahéliens est leur aptitude à une bonne et
abondante nodulation en serre ou en pépinière, mais dés que ces plantes sont transplantées en
conditions naturelles les nodules deviennent rares et à la limite disparaissent presque
totalement (Dreyfus et Dommergues, 1986). Nous pouvons aussi citer les notes rapportées
par Barnet et al., 1987 qui mentionnent que dans les plantations d'Acacia longifolia et A.
saligna, la nodulation est éparse, erratique et les nodules difficiles à trouver.
Plusieurs raisons dont la température alliée à la sécheresse ont été invoquées pour expliquer
cette absence ou défaut de nodulation en conditions naturelles; d'autre part le phénomène de
recyclage de l'azote essentiellement à partir de la litière constitue une des sources
principales d'azote apportée par l'écosystème (Mahendrappa et al., 1986).

48
Bernardt-Reversat et Poupon (1980), ont suggéré que l'absence de nodulation sur les
arbres adultes d'Acacia senegal, serait à relier avec la forte nitrification dans les sols situés
sous la canopée pendant la saison sèche.
Un autre facteur identifié est la sécheresse. En effet Dreyfus et al., 1988 ont noté une
abondante nodulation sur des racines peu profondes d'A. albida se développant dans des sols de
rizières souvent inondées et où ils ont pu observer une importante population rhizobienne.
Cette absence de nodulation dans les populations naturelles n'est pas causée par une absence
de souches de Rhizobium dans le sol puisque des prélevements de sols effectués depuis la
surface jusqu'à une profondeur de 34m sous des pieds d'Acacia albida ont montré qu'il existe
d'importantes populations de Bradyrhizobium se développant jusqu'a 34m de profondeur; il
est apparu aprés caractérisation de ces souches, que les souches de surface seraient les
mêmes que les souches de profondeur puisque les premières auraient suivi la croissance du
système racinaire en profondeur (Dupuy et Dreyfus, 1992). Certaines de ces souches de
Bradyrhizobium sont des souches photosynthétiques ; cette propriété n'étant pas observée
uniquement chez A. albida mais aussi chez Aescyhynomenae sp. (Dupuy et aL, 1994).
4-2) la disponibilité en phosphore assimilable
Les phosphates assimilables demeurent une des contraintes majeures largement rencontrées
dans la plupart des sols tropicaux. La déficience en Phosphore du sol peut affecter la
disponibilité en source d'energie (ATP) ; les importants besoins en phosphore qui constitue
une part intégrante de la molécule d'ATP qui fournit l'énergie nécessaire à la symbiose,
peuvent être comblés par l'apport de fertilisants, mais la plupart des espèces peuvent tirer
un grand profit en s'associant avec les champignons pour former des mycorhizes capables de
solubiliser les phosphates.
Sanginga et al., 1988 ont montré que Leucaena leucocepha/a a besoin d'un apport exogéne en
phosphore pour activer sa croissance et améliorer son potentiel fixateur. Benge (1983),
Sanginga (1988) ont montré que l'addition de phosphore entraine une augmentation du taux
de Phosphore et d'azote contenus dans les tissus de la plante. Il est apparu (Sanginga et al.,
1990) que le phosphore améliore la nodulation mais n'a pas d'effet significatif sur la
quantité d'azote fixé; l'effet du phosphore sur la fixation d'azote est indirect puisqu'en
améliorant la croissance, il augmente la quantité d'assimilats disponibles pour la fixation
biologique de l'azote.
Les carences en phosphore peuvent être comblées par une inoculation mixte Rhizobium et
Mycorhize à vésicules et à arbuscules (VAM). Chez Acacia albida (Ducousso et aL, 1992 ;
Gueye, 1992) la double inoculation agit favorablement sur la nodulation et sur la croissance
des plants. Chang et aL, 1986 sur Acacia auriculiformis a montré que la double inoculation

49
augmente de manière significative la croissance par rapport à un inoculation simple et par
rapport aux témoins non inoculés.
De nombreux travaux ont confirmé les effets bénéfiques d'une inoculation mixte Rhizobium/
Mycorhize sur Leucaena leucocepha/a, Cajanus cajan (Lucena -Costa et Paulino, 1990),
Gliricidia sepium (Osunde, 1992) Sesbania grandiflora (Habte et Aziz, 1985).
Werner et al., 1984 avaient montré que l'infection VAM était obligatoire pour une
installation adéquate de la symbiose rhizobienne. Les mycorhizes améliorent la nutrition
minérale phosphatée et mettent à la disposition de la plante des éléments qui favorisent la
fixation en particulier les ions Zn, Cu, Mo etc... (Sowen, 1980).
Les bénéfices essentiels tirés de l'inoculation VA sur des espèces ligneuses légumineuses en
zone aride et semi-aride résident en particulier dans l'amélioration de l'absorption en eau et
et dans la stimulation de la nodulation (Diop et al., 1994). Il est heureux de remarquer que
la faj~le spécificité des souches VA vis à vis des espèces-hôtes ainsi que l'ubiquité des
souches de champignons, permet une infection quasi spontanée des plantes dès leur mise en
place, ce qui permet de les mettre dans des conditions favorables pour supporter les
rigueurs de l'environnement sahélien.
4-3) l'efficience des souches
Généralement les études agronomiques ont montré (Weaver et Frederick,1974) que les
populations natives de Rhizobium ne sont pas toujours les plus efficientes et les souches
introduites et sélectionnées pour leur fort potentiel en fixation leur sont souvent préférées.
L'absence ou l'inefficience des souches dans le sol constitue un élément fondamental dans la
réussite de ('inoculation dans des conditions naturelles de champ.
La conséquence pratique en est la nécessité d'inoculer très tôt en pépinière en utilisant des
souches performantes de Rhizobium. Chez Leucaena leucocephala, la souche utilisée comme
inoculum s'est révélée trés compétitive (Sanginga et al.,1990) puisqu'elle a réussi à
s'établir dans les sols des différents sites où la plantation a été effectuée. Les populations
rhizobiennes se sont maintenues un an aprés et se sont sont révélées trés infectives.
La spécificité du spectre d'hôte a été souvent étudiée car si les souches de Rhizobium sont
"promiscuous", l'inoculation ne devient plus nécessaire. La plupart d'espèces d'arbres telles
que Acacia albida, A. holosericea, Prosopis africana (Duhoux et Dommergues,1988) sont
dites "promiscuous" ; alors que d'autres espèces telles que Leucaeana leucocephala, Acacia
senegal, Prosopis juliflora, Sesbania sp. sont trés spécifiques dans leurs associations
symbiotiques.
5 ) INFLUENCE DU GÉNOTYPE DE LA PLANTE-HÔTE

50
L'existence d'une variabilité intra-spécifique dans l'aptitude à fixer l'azote atmophérique a
été bien établie chez les plantes annuelles, (Caldwell et Vest, 1977, Vincent,1984); le
génotype joue un rôle essentiel dans l'expression du potentiel de fixation (Heichel et Vance,
1983; Graham et Temple, 1984).
Sougoufara et aL, (1989) a montré l'importance de
la variabilité intra-spécifique en
utilisant des clones issus de boutures herbacées de Casuarina equisetifolia ; l'aptitudeà fixer
l'azote varie dans des proportions allant de 1 à 2,5 fois plus entre les clones bons fixateurs
et les clones mauvais fixateurs. Ces importantes différences se retrouvent sur les mêmes
clones cultivés au champ (Dreyfus et aL,1989).
L'amélioration symbiotique en utilisant la sélection par voie de clonage de la plante-hôte,
s'est avérée trés efficace (Simon et al.,1985; Tremblay et al.,1984, Sougoufara et aL,
1990) . Sur Acacia mangium (Galiana et aL, 1991), il est apparu que le génotype de la
plante_-hôte est tout aussi important que la souche de Rhizobium et qu'il est possible de
sélectionner isolément les deux partenaires puisqu'il n'éxiste aucune interaction entre la
plante-hôte et le micro-symbionte chez cette espèce.
6)
L'INFECTION
BACTÉRIENNE
Généralement lorsqu'une plante se trouve en contact avec une bactérie, elle développe une
réaction de défense contre le microbe. Mais dans le cas de la symbiose, la plante et le micro-
organisme possèdent des signes de reconnaissance permettant à la bactérie d'envahir les
cellules de l'hôte. Ces mécanismes de reconnaissance sont liés à la spécificité ou non de
l'association. En effet, il est apparu qu'il éxiste différents niveaux de spécificité plante-hôte
/Rhizobium à l'intérieur d'une même espèce, entre différents groupes d'inoculation croisée
et à l'intérieur d'une famille entière. Ceci implique que la spécificité fait intervenir non pas
une molécule signal mais tout un ensemble d'interactions. Cette variabilité peut être
naturelle ou induite par des mutations, elle révèle l'étendue de la base génétique de la
specificité de l'infectivité.
6-1) Evénements à la surface de la cellule
L'interaction entre les deux partenaires de la symbiose débute à la surface des cellules de la
racine. De récents développements ont montré que la reconnaissance entre la plante et la
bactérie nécessite l'intervention de molécules-signal; la plante-hôte libère des subtances
(flavonoides) (Harwig et al., 1990) qui activent les gènes nod de la bactérie; à leur tour ces
gènes nod codent pour des enzymes intervenant dans la biosynthèse des facteurs nod qui sont
des oligo-saccharides diversement substitués intervenant dans la spécificité de l'hôte; ces
facteurs Nod provoquent non seulement des modifications de la morphologie de la racine

51
(Lerouge et aL, 1990) , mais aussi stimulent l'initiation du primordium nodulaire (Truchet
etaI., 1991).
6-2) Pénétration
Il existe 3 modes de pénétration des Rhizobium au sein de la plante-hôte:
- le premier, le plus fréquent chez les légumineuses tempérées et tropicales
(Newcomb, 1980; Bauer, 1981; Sprent et de Faria, 1988) fait intervenir les poils
absorbants à l'intérieur desquels se forme un cordon d'infection
- le second mode de pénétration emprunte les espaces intercellulaires et les
déchirures au niveau des
cellules corticales ou épidermiques; c'est le mode dit "crack
entry" (Lancelle et Torrey ,1983)
- le troisième mode n'utilise ni les poils absorbants ni les zones de déchirure mais
l'infection s'effectue par colonisation des espaces intercellulaires entre deux cellules
épidermiques adjacentes.
A)
infection par poils absorbants
L'invasion du poil absorbant se caractérise d'abord par l'enroulement en crosse
caractéristique. C'est le phénotype Hac où On observe une déformation et un enroulement du
poil sur 360°. Par la suite se forme au niveau de la poche créée par la courbure du poil, un
point réfringeant qui deétermine le point par où pénétre le Rhizobium dans la cellule de
l'hôte.
Par une dissolution partielle de la paroi de la cellule et un dépôt concommittant de matériaux
d'une nouvelle paroi, le cordon d'infection se forme. Le cordon d'infection est une structure
tubulaire qui transporte des bactéries souvent alignées sur une seule file; à l'intérieur, les
cellules bactériennes se divisent et le cordon s'accroit et se dirige vers la cellule corticale
adjacente au poil.
Simultanément à la croisance du cordon d'infection, se différencie à distance du poil infecté,
au sein du cortex et contre le péricycle, des amas de cellules méristématiques initiant le
primordium nodulaire.
Au bout de sa progression, à proximité du primordium nodulaire, le cordon se ramifie et
pénétre les cellules corticales. Les Rhizobium sont lâchés à l'extrêmité du cordon dans le
cytoplasme des cellules du cortex et par un phénomène d'endocytose, les bactéries sont
entourées d'une membrane originaire du plasmaleme de la cellule-hôte: la membrane péri-
bactéroidienne (Newcomb, 1981). La cellule corticale infectée est siège d'une intense
activité métabolique, le noyau augmente de volume et devient polyploïde ; le micro-
organisme se transforme en bactéroide qui est la forme différenciée de l'endosymbionte.

52
B) infection par
"Crack entry"
Ce mode d'infection particulier se déroule en l'absence de cordons d'infection au cours des
premiers stades de l'infection. Les bactéries accèdent aux cellules corticales par
l'intermédiaire de déchirures au niveau des cellules épidermiques. Ce type d'infectiOn a été
bien décrit chez Stylosanthes (Chandler et aL, 1982), Arachis hypogae (Chandler 1978),
Aeschynomenae (Yatazawa et aL,
1984; Alazard et Duhoux 1990), et Sesbania
(Duhoux,1984). Bien que la présence de poils absorbants soit nécessaire au processus de
l'infection, les cellules bactériennes empruntent les espaces intercellulaires situés entre la
paroi du poil absorbant et les cellules épidermiques ou corticales adjacentes. Aprés
altération de la paroi des cellules basales du poil, les Rhizobium envahissent les cellules ;
ces ce!lules se divisent et vont plus tard former un tissu nodulaire caractérisé par l'absence
de cellules non envahies. Chez Aeschynomenae afraspera (Alazard et Duhoux,1990) les
premières cellules du cortex infecté ne se divisent pas mais elles se désorganisent pour
former des espaces intercellulaires contenant de nombreuses bactéries en division.
L'invasion se propage ainsi par la succession de phases de désorganisation progressive suivie
de phases de multiplication au niveau des espaces intercellulaires et gagne le cortex interne.
A ce niveau les bactéries envahissent les cellules par invagination de la paroi et investissent
le méristème nodulaire.
Leur propagation s'effectue par la suite en utilisant la voie intercellulaire grâce à de minces
cordons d'infection.
C) infection
par
poches
intercellulaires
Ce mode d'infection a été décrit pour la première fois par de Faria et aL, 1988 chez Mimosa
scabrella ; dans
ce cas précis, la colonisation des cellules s'effectue par l'intermédiaire
d'espaces intercellulaires à travers les parois primaires des cellules ; les bactéries se
multiplient puis pénétrent dans les cellules adjacentes aprés invagination de la paroi
cellulaire mais elles demeurent entourées par la paroi de la cellule hôte sans être lâchées au
sein du cytoplasme.
16-3) Développement du nodule
Quel que soit le mode d'infection, le processus de la formation du nodule suit un modèle
identique.
Les caractéristiques de la forme du nodule sont déterminées par le génotype de la plante-
hôte ; le nodule qui se forme est une structure particulière qui présente une organisation
typique pour chaque espèce. On distingue généralement deux types de nodules:

53
A)
les nodules à croissance déterminée
Ils sont souvent sphériques ovales et sont surtout caractérisés par la présence d'un
méristème à activité limité.e dans le temps et une synchronimie dans les stades de
développement des. cellules (Newcomb, 1980).
Une coupe transversale de ces nodules
déterminés montrent deux types de tissus (Taté et aL, 1994) :
- un tissu périphérique composé du cortex externe de l'endoderme et du cortex
interne avec les vaisseaux conducteurs
- un tissu central constitué de cellules envahies par les bactéroides, et de cellules
non envahies.
L'accroissement des nodules ne se fait pas en longueur mais en épaisseur.
Ce type est fréquemment observé dans la tribu des Phaseolae et des Papillionidés (Sprent et
de Faria, 1988) et en particulier chez le soja, le haricot, l'arachide, Stylosanthes,
Aechynomenae afraspera (Dart 1975, Newcomb et Mc Intyre, 1981; Chandler et al.,1982,
Alazard et Duhoux, 1990). Chez ces espèces la forme majeure par laquelle l'azote issu de la
fixation est transporté est la forme uréide (allantoïne et acide allantoique) (Sprent et de
Faria, 1988).
B)
les nodules
à croissance indéterminée
Ils sont de forme allongée, oblongue ou en collerette; l'activité du méristème est continue
tout au long de l'ontogénèse du nodule ce qui permet de distinguer plusieurs zones d'âges
differents :
- une zone (1) apicale dépourvue de bactéries de nature méristématique
- une zone d'invasion (II) où les cordons d'infection pénétrent au niveau des cellules
nouvellement divisées
- une inter-zone (II-III) caractérisée par la présence de cellules envahies riches en
amyloplastes (Vasse et al. ,1990)
- une zone (III) ou s'effectue la fixation d'azote avec des cellules envahies remplies de
bactéroides
- une zone (IV) de sénescence
Ils sont caractéristiques des espèces tempérées telles que le trèfle, la luzerne et le pois.
Ils sont caractéristiques des espèces appartenant aux tribus des Viciae et des Trifoliae et de
la plupart des espèces de légumineuses tropicales, dont les formes amides (Asparagine et
glutamine) sont les principales formes d'exportation de l'azote (Pate et al.,1969).
Chez A. albida des travaux récents (Diouf, 1995) ont montré la forme prépondérante sous
laquelle l'azote est transportée est la forme amides (glutamine et asparagine).
7) DIVERSITÉ
TAXONOMIOUE
ET
SPÉCIFICITÉ
DES
RHIZOBIUM
(s.1)

54
7-1) Diversité taxonomique
Le genre Rhizobium, a été décrit dans le Bergey's Manual of determination
Bacteriology (8e Edition) (1974) comme un genre constitué de 6 espèces déterminées sur la
base des spectres d'hôte. En 1984 Jordan établit la distinction entre les Rhizobium à
croissance rapide (R. melilotii, R. phaseoli, R. leguminosarum et R. fredii ) et des
Bradyrhizobium à croissance lente (B.. lupini et B.japonicum).
De grandes avancées ont été obtenues dans l'étude taxonomique rhizobienne grâce à 1
l'utilisation des séquences d'ARN ribosomal 165 qui ont permis d'établir des relations
phylogénétiques entre les diffeérentes souches utilisées ( Woese, 1987 ; Young, 1991 ; de
Bruijn 1992 ; 5awada et al., 1983). L'analyse des séquences de ribosomes 165 révèle que
Rhizobium et Bradyrhizobium sont trés distincts et que chaque groupe présente de fortes
affinités avec d'autres genres de bactéries non fixatrices
telles que Agrobacterium,
Brucella, Phyllobacterium (Yanagi et Yamasato, 1993) et Rhodopseudomonas et Afipia
(Willems et Collins ,1992; Dupuy N.,
1993) respectivement pour Rhizobium et
Bradyrhizobium. Actuellement on considère qu'il existe 3 genres formant des groupes bien
différenciés :
Rhizobium, Bradyrhizobium
(Jordan,1984) et Azorhizobium ( Dreyfus et al., 1988)
(Tabl W2)
Tabl N° 2: Bactéries symbiotiques des plantes supérieures et leurs hôtes
Esœces
Plantes - hôtes
Rhizobium meliloti
Medicago, Melilotus, Trigonella
Rhizobium fredii , R. xlnJlangensis
Glycine max, soja et autres légumineuses
Rhizobium leguminosarum
bv. viciae
Pisum , Vicia
bv. trifolii
Trifolium
bv. phaseoli
Phaseolus
Rhizobium tropici
Phaseolus vulgaris,Leucaena spp.
Rhizobium etli
Phaseolus vulgaris
Rhizobium galegae
Ga/ega officina/is, G. orientalis
Rhizobium loti
Lotus spp.
Rhizobium huakii
Astragalus sinicus
Bradyrhizobium japonicum
Glycine max
Bradyrhizobium elkanii
Glycine max
Azorhizobium caulinodans
Sesbania rostrata

ss
Tout récemment un genre Sinorhizobium a été mis en évidence reclassant Rhizobium meliloti
en Sinorhizobium meliloti et ajoutant deux nouvelles espèces Sinorhizobium teranga et S.
saheli (Lajudie et aL,1994)
7-2) Specificité des souches de Rhizobium
L'assocation symbiotique plante-Rhizobium présente deux niveaux de spécificité: l'une
relative à la reconnaissance qui aboutit à la formation de nodules, l'autre relative au
fonctionnement de la symbiose qui a pour résultante la fixation de molécules d'azote et leur
transformation en NH3 et en azote organique.
L'analyse génétique fournit des informations sur les génes responsables de la reconnaissance
entre la bactérie et l'hôte, le mécanisme de l'induction puis de la différenciation du nodule.
L'utilisation de mutants a été d'un grand apport dans l'élucidation des interactions
Rhizobium/Plante-hôte. De nombreux génes ont été clonés puis séquencés (Downie, 1985 ;
Jacobs et aL, 1985) aussi bien au niveau de la plante- hôte qu'au niveau du micro-
symbionte.
Chez les plantes fixatrices d'azote, les molécules responsables de la nodulation sont des
protéines spécifiques appellées nodulines (Legocki et Verma 1980 ; Vjin et aL, 1993 ).
Les gènes nod spécifiques sont les gènes responsables de la spécificité du spectre d'hôte. Des
mutations au niveau de ces gènes entraînent des modifications au niveau du spectre d'hôte
(Debellé et Shamme, 1986).
Parmi les nodulines tardives qui ne s'expriment qu'au moment où l'association symbiotique
est fonctionnelle, la leghemoglobine est la plus étudiée et la mieux connue.
La leghémoglobine est constituée de deux parties dont l'une l'hème est synthétisée par
la bactérie alors que la globine est synthétisée par la plante. Cette molécule est responsable
de la régulation du niveau d'oxygéne dans les cellules du nodule.
Il existe d'autres nodulines tardives telles que les nodulines de la membrane péri-
bactéroidienne (Mouisson et Desh Phal verma, 1987), les nodulines qui agissent sur le
métabolisme azoté telles que
la glutamine synthetase (Lara et aL, 1983) la malate
deshydrogénase (Appels et Haaker , 1987) et l'uricase (Bergmann et aL, 1983).
Le concept de spécificité et d'efficience de la symbiose a été discuté par de nombreux auteurs
; en effet de nombreuses espèces de légumineuses tropicales nodulant avec des souches de
Rhizobium sont capables de noduler avec des souches de Bradyrhizobium (Dreyfus 1988). Ce
phénomène a été observé chez Acacia senegal (Dreyfus et Dommergues,1988), Leucaena
leucocephala (Sanginga et al., 1988) et chez Faidherbia albida (Gueye, 1992).
De plus il est généralement admis que les plantes-hôtes qui s'associent de préférence avec
des souches de Bradyrhizobium sont généralement non-spécifiques dans leur spectre d' hôte.
Diagne (1986) a montré que Prosopis juliflora est une espèce trés spécifique et n'est nodulé

56
que par des souches de Bradyrhizobium alors que Prosopis africana est nodulé à la fois par
des souches à croissance rapide et par des souches à croissance lente.
TabL N° 3: Spécificité de la nodulation chez quelques légumineuses à usages multiples
(Danso et al.,1992)
Espèces
Nodulation par
References
B et/ou R*
Acacia albida
B
Dommergues ,1987
A. constricta
R
Waldon et aL,1989
A. holosericea
B
Dreyfus et Dommergues 1981
A. longifolia var. sophorae
R
Lawrie 1983
A. mearnsii
B
Lawrie 1983, Dommergues 1987
A. melanoxylon
B
Lawrie 1983
A. nilotica
R
Dommergues ,1987
A. raddiana
R
Dommergues ,1987
A. saligna
R,B
Barnet et aL,1985
A. senegal
R
Dommergues ,1987
A. seyal
R,B
Dommergues ,1987
A. tumida
R,B
Habish et Khairi 1970
Albizzia lebbeck
B
Dreyfus et Dommergues 1981
Calliandra caHothyrsus
R
Dommergues ,1987
Erythrina poeppigiana
B
Dommergues ,1987
Gliricidia sepium
R,B
Dommergues ,1987
Leucaena leucocephala
R,B
Dommergues ,1987
mimosa scabrel/a
R,B
Dommergues ,1987
prospis alba
R
Torres, 1985
P. chilensis
R
Olivares et a1., 1988
P. glandulosa
R,B
Jenkins et al.,1989
Sesbania grandiflora
R
Dommergues ,1987
*B= Bradyrhizobium
R= Rhizobium

MATERIELS ET
METHODES

S9
A) BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION
1) SITUATION GÉO-CLIMATIOUE DE LA RÉGION
L'étude a été menée dans la région de Dakar (14° 43' N, 1r 26' W). Le climat y est
sahélien influencé par l'alizé maritime qui atténue les maxima de température et réduit le
déficit hygrométrique pendant la saison sèche; la moyenne annuelle de température y est de
24 oC et la pluviométrie annuelle est de l'ordre de 300 mm.
2) LOCALISATION DES ARBRES ÉTUDIÉS
Les arbres étudiés ont été localisés sur les sites ci-aprés (voir carte) :
Site Bel-air (ORS)
Site Hann (HAN)
Site Dalifor (DAL)
Site Foire (FOR)
Site Université (UNI)
Ces sites ont été choisis sur la base de leur accessibilité et du nombre d'individus
suffisamment représentatifs par population. Une dizaine d'arbres par site ont été choisis sur
la base de leur stade phénologique (floraison ou fructification) et de l'accessibilité des
fleurs.
3) ETUDE PHÉNOLOGIOUE ET DE LA MORPHOLOGIE DES ORGANES FLORAUX
Aprés avoir identifié par un marquage à la peinture des branches terminales réparties au
hasard sur chaque arbre, nous avons établi la cartographie du rameau inflorescentiel.
L'ordre d'apparition des inflorescences est déterminé à partir de la zone de ramification
(fig. 1); le nœud d'ordre 0 est situé à l'intersection entre le rameau n et le rameau latéral
n+ 1 portant les inflorescences.
Les inflorescences sont récoltées, les fleurs dissequées, les anthères séparées des carpelles
et conservées dans de l'alcool 70% . Le nombre de monades est déterminé par observation et
comptage à partir de grains de pollen frais au microscope optique; le nombre d'ovules est
compté aprés avoir sectionné longitudinalement les ovaires; une autre variante a été
utilisée pour compter le nombre d'ovules par carpelle: à la suite d'un traitement
éclaircissant à l'eau de javel (12°Cl) pendant 4 heures et d'un abondant rinçage à l'eau, les

60
carpelles sont colorés au bleu d'aniline et les ovules colorés en bleu sont parfaitement
identifiables au microscope optique.
Les photos de surface des organes floraux ont été faites au M.E.B. aprés fixation dans
l'éthanol 100 et déshydratation dans de l'acétone pur et passage au point critique et enrobage
dans une fine pellicule de métal. Les échantillons sont observés au microscope électronique à
balayage type JEOL JMS 35 CF.
4) EnlDE DE LA STRATÉGIE REPRODUCTIVE CHEZ ACACIA ALBIDA
4-1) RÉCEPTIVITÉ DU STIGMATE
La période de réceptivité du stigmate est déterminée par le test de l'activité estérasique. En
présence du substrat, l'a-naphtyl acetate, on note une activité enzymatique décelable par une
coloration rouge dont l'intensité varie en fonction du degré de réceptivité stigmatique
(Heslop-Harrison et Shivanna,1977). Nous avons choisi les fleurs à différents stades de
développement :
A: bouton floral de 5 mm
B : début d'ouverture de la fleur
C : ouverture de la fleur le stigmate émergeant de la masse des filets staminaux
D: anthèse
E : fin de l'anthèse début de la fanaison
F : fleurs demeurées sur l'épi inflorescentiel aprés que toutes les autres se soient
anées et présentant un style encore turgescent.
4-2) VIABILITÉ DU POLLEN D'Acacia albida
Les inflorescences sont récoltées au moment où les fleurs, situées sur le rameau
inflorescentiel se trouvent à un stade de début d'ouverture du bouton floral juste avant
l'anthèse; elles sont placées dans des sachets en polyétyhylène fermées mais aérées. La
récolte du pollen s'effectue en secouant délicatement à l'aide d'un pinceau les inflorescences
déjà ouvertes. Sur les inflorescences au stade de bouton de 4 à 5 mm restées fermées, et
conservées dans le sachet en polyéthylène, les anthères s'ouvrent à l'intérieur du bouton
floral et libérent les grains de pollen. Ces grains de pollen sont protégés de la dessication par
la présence des enveloppes florales. Le pollen est séparé des débris végétaux en le placant
sur un tamis de maille de 150 JJm; il est conservé dans une boite de pétri à la température
ambiante du laboratoire (20°C).

61
La viabilité des grains de pollen est estimée par deux tests:
A) le test FCR (fluorochromatique reaction) (Heslop-Harrison et al.,1984).
Le principe du test est le suivant : le grain de pollen présentant une membrane intacte
contient une estérase qui en présence de di-acétate de fluorescéine clive la molécule pour
libérer la fluorescéine; cette fluorescéine s'accumule au sein de la cellule et à l'observation
au microscope, il est possible de détecter les cellules qui fluorescent des autres non
fluorescentes.
Deux traitements ont été appliqués aux grains de pollen:
a) Les grains de pollen sont conservés intacts et protégés à l'intérieur des tissus
floraux.
. b) les grains de pollen sont isolés des anthères et placés dans des boites de Pétri à
tempé-rature ambiante, où ils subissent une déshydratation plus ou moins poussée.
Puis les pollens sont placés dans une goutte de liquide constituée d'une solution satùrée de
di-acetate de fluorescéine (0,2 mg/ml) additionnée de milieu Brewbaker et Kwacks (1963)
contenant 20 g/l de saccharose. Le mélange est placé sur une lame de microscope et les
grains de pollen fluorescent au bout de quelques minutes. L'observation s'effectue en
épifluorescence sous une longueur d'onde émettant une lumière bleue. L'estimation de la
viabilité est évaluée selon l'intensité de la fluorescence émise par les monades.
B) l'étude de la capacité de germination des monades et la croissance du tube
pollinique en condition "in vitro".
Les grains de pollen conservés en boite de Pétri, sont mis à germer sur deux milieux (voir
annexes):
- BK (Brewbaker et Kwacks, 1963 )
- milieu GM simplifié contenant du Ca (N03)2 3.10-3 M et de H3B03 2. 10-3 M .
Le saccharose est ajouté au milieu à différentes concentrations (5,10, 20 et 30 g/l).
Plusieurs gammes de pH ont été testées (5, 6, 6.4 , 7).
Les milieux sont solidifiés par le phytagel (2g/l). L'incubation s'effectue à l'obscurité à
30°c dans une ambiance saturée en humidité grâce à la fermeture hermétique de la boite
contenant les lames sur lesquelles s'effectue la germination. Au bout de 12 à 24 heures de
culture, les échantillons sont retirés et observés sous la loupe à lumière froide
et au
microscope optique (Jena).
4-3)POLLINISATION CONTROLÉE
Au cours de cette expérience, nous avons cherché à déterminer de manière
quantitative le niveau d'auto-incompatibilité d'individus provenant de populations naturelles
d'A. albida.. Cette expérience vise à étudier le mode de fécondation allogame ou autogame
dominant chez A. albida .

62
Nous avons utilisé l'index d'auto-incompatibilité (ISI) qui est le rapport entre le nombre
d'infrutescences ou de gousses obtenues a la suite de l'auto-fécondation sur le nombre
d'infrutescences obtenues aprés fécondation croisée. Lorsque le rapport est compris entre a
et 0,2 l'espéce est auto-incompatible; lorsqu'il est compris entre 0,2 et 1, elle est
partiellement auto-compatible ; au-delà de 1, l'espèce est totalement auto-compatible. Cet
index a été developpé par Zappata et Arroyo (1978) et utilisé par Kenrick et Knox, 1989
sur les Acacia australiens et par Tybirk, 1993 sur A. tortilis.
Nous avons identifié 8 arbres sur deux sites Uni et Foi. Aprés avoir choisi les
rameaux floriféres portant de nombreuses inflorescences au stade optimal, nous avons
enlevé les boutons trop jeunes, les fleurs déja ouvertes et nous avons conservé les boutons
médians.
5 traitements ont été mis en place :
A- Témoins absolus ensachés sans manipulation des inflorescences (Témoins); nous
avons laissé ces témoins absolus qui ne subissent aucune manipulation au cas où il y'aurait
éventuellement une pollinisation autogame ou bien urtapomixie.
B-Témoins ensachés mais dont les épis sont légèrement secoués à l'intérieur de la
poche pour favoriser, par un déplacement du pollen, la mise en contact de ce dernier avec le
stigmate (Auto S-M).
C- Inflorescences ensachées et auto-fécondées manuellement par badigeonnage avec
des inflorescences récoltées au stade de l'anthèse sur le même arbre (Auto-M)
0- Inflorescences ensachées et allo-fécondées par badigeonnage avec des
inflorescences récoltées au stade de l'anthèse récoltées sur un arbre different (Allo); les
croisements sont numérotés, les parents mâles et femelles identifiés.
E- Les épis sont identifiés mais ne sont pas ensachés et la pollinisation se fait par
voie naturelle (Poli Nat).
Nous avons utilisé des poches fabriquées en gaze fine blanche, qui laissent passer les
gaz, la lumière et ne modifient pas l'humidité à proximité des inflorescences.
3 jours aprés l'ensachage, nous avons enlevé tous les boutons non encore ouverts; aprés
avoir récolté des inflorescences dont les fleurs étaient au stade de l'anthèse, nous avons
fécondé les fleurs à polliniser avec ces inflorescences puis refermé les poches.
2 semaines aprés l'ensemble des rameaux floriféres a été récolté, le nombre de
gousses comptées et l'index d'auto-incompatibilité (ISI pour Index of Self Incompatibility )

63
calculé par la méthode de Lloyd (1965). Nous avons utilisé le nombre d'inflorescences
produisant des gousses pour déterminer le rendement de la pollinisation.
Les tests statistiques par analyse de variance (test de Fischer à 95%) ont été effectués.
B) MICROPROPAGATION VÉGÉTATIVE CHEZ ACACIA ALBIDA
1) MICROPROPAGATION VÉGÉTATIVE PAR BOURGEONNEMENT AXILLAIRE
1-1) Matériel végétal
La micropropagation est réalisée à partir de noeuds de rameaux prélevés sur des arbres
adultes. Ces arbres adultes sont situés dans l'enceinte de l'université de Dakar; certains pieds
sont localisés au niveau du jardin botanique ou derrière l'Office du Bac. Les prélévements se
font tout au long de l'année. Le matériel végétal choisi est constitué soit de drageons, de rejets
ou de pousses florifères prélévées sur la cime de l'arbre.
Chaque noeud (environ 1 cm) porte à l'aisselle des feuilles entre les épines stipulaires un
bourgeon.
1-2) Désinfection du matériel
La désinfection s'effectue par pré-trempage des nœuds débarrassés de leurs feuilles, dans de
l'alcool 70% suivi d'un trempage dans une solution de chlorure mercurique (0,1%)
additionné d'un mouillant le tween 20. La désinfection dure 5 mn et elle est suivie de 5
rinçages à l'eau distillée stérile.
1-3) Milieux et conditions de culture
Des drageons constitués de tiges feuillées de 9 à 10 cm ont été prélevés puis placés dans les
solutions aqueuses suivantes en vue d'un pré-trempage précédant l'indroduction "in vitro";
eau distillée
MS= milieu Murashige et Skoog complet
MS -oligo = milieu MS sans oligo-élements
MS/2 + N03= Milieu MS dilué de 112 sans autre source d'azote que N03 (x M)
MS/2 +NH4= Milieu MS dilué de 112 sans autre source d'azote que NH4 (x M)
MS/2 -N= Milieu MS dilué de 112 sans aucune source d'azote

64
Cinq milieux minéraux de base (Composition voir en annexe) ont été testés
Murashige et Skoog (1962) ; Quoirin -Lepoivre (1977); Gamborg et al., (1968) ; Nitsch
et Nitsch (1965) ; Lloyd and Mc Cown (WPM) (1985). Ces milieux sont additionnés de
vitamines de Murashige et Skoog (1962) ainsi que de substances de croissance: ANA (acide
naphtalene acetique); AIB (Acide indolyl-butyrique) et AIA (acide indolyl acetique) à des
concentrations variant de a à 5 mg/I ainsi que d'une cytokinine la BAP (Benzyl amino
purine).
Aprés addition de saccharose (3%), les milieux dont le pH est ajusté à 5,5 /
5,6 sont
solidifiés par l'agar (Bacto Difco agar) (9 g/I). Aprés stérilisation à l'autoclave (20 mn à
120 OC), le charbon actif est ajouté stérilement au milieu de culture.
. Afin de prévenir la défoliation des vitroplants, des substances ont été ajoutées au
milieu MS de base. Les différentes substances utilisées pour prévenir l'abscission foliaire et
stimuler le développement sont: la glutamine,
l'adénine et le phloroglucinol (1,3,5-
Trihydroxybenzène) à des concentrations variant entre 100 mg/I et 1000 mg/I.
Pour intensifier la multiplication, les explants primaires pourvus de leur bourgeon
axillaire, sont trempés dans une solution aqueuse de BAP trés concentrée (20 mg/I)
préalablement stérilisée à l'autoclave, agités par rotation pendant 15 heures. A la suite d'un
rinçage à l'eau distillée stérile, les noeuds sont cultivés sur MS contenant uniquement de
l'AIA comme substance de croissance.
L'enracinement des tigelles s'effectue sur différents milieux en présence d'auxine (AIA , AIB
et ANA) à des concentrations variant entre a et 5 mg/!.
Afin d'étudier la nutrition minérale azotée chez Acacia albida, nous avons utilisé les
macro-éléments et les micro-éléments de Murashige et Skoog additionnés de diverses formes
d'azote (minérale et organique) à des concentrations variées. Les explants sont constitués de
clones d'individus agés de deux ans cultivés "in vitro".
Ces milieux sont décrits ci-a prés :
1 -
Milieu 0 sans azote (MS N)
2 -
Milieu MSN + N03 (5 mM Il)
3 -
Milieu MSN + N03 1 NH4 : (5 mM 1 20 mM)
4 -
Milieu MSN + N03 1 NH4: (1 mM 1 20 mM)
5 -
Milieu MSN + Asparagine (3,5 mM Il) =500mg/L
6 -
Milieu MSN + Glutamine (0,7 mM Il) =100 mg/L
7 -
Milieu MSN + NH4 (
20 mM Il)
8 -
Milieu MSN + Glutamine ( 3,5 mM Il) =500mg/l)

65
9 -
Milieu MSN + Asparagine (0,7 mM Il) =100 mg/l)
10- Milieu MSN + NH4 (1 mM Il)
11- Milieu MSN + NH4 (SmM Il)
12- Milieu MSN +N03 (20 mM/I)
13 - Milieu MSN + N03 ( 1 mM Il)
2) - EMBRYOGENESE SOMATIQUE
2-1) Matériel végétal
Dans le but de déclencher une embryogénèse à partir de cals, des graines matures d'A.
albida (Provenance Ouadiour) agées d'un an, ont été utilisées comme expiant.
Les graines sont scarifiées dans de l'acide sulfurique à 98 % pendant 20 min puis rincées
abondamment à l'eau distillée. La désinfection s'effectue par trempage dans une solution
aqueuse d'hypochlorite de Ca (140 g/l) pendant 20 min, suivie de 5 rinçages à l'eau distillée
stérile.
La germination des graines s'effectue à l'obscurité dans une étuve à 29° C sur un support
inerte constitué de coton hydrophile imbibé d'eau distillée stérile. La germination survient
au bout de 48 heures, avec un taux optimal de 98% environ.
2-2) Mise en culture et conditions de culture
Les prélèvements et mises en culture se font sur des plants âgés d' 1 à 6 jours. Les
différentes parties de la plante sont excisées cotylédons, embryon sans les cotylédons,
portion d'hypocotyle, d' épicotyle, foliole; sur certains explants (cotylédon et foliole), la
partie superficielle est incisée pour favoriser la callogénèse.
La formation des embryons somatiques nécessite l'induction préalable de la callogénèse sur
un milieu auxinique (AIA ou 2-40) suivie d'une phase d'induction et d'expression de
l'embryogénèse somatique aprés suppression de l'auxine et addition de cytokinine et de
substances favorables à l'embryogénèse (hydrolysat de caséine et cocktail d'acides aminés).
Le milieu minéral de Gamborg (1965), en présence d'une auxine l'AIA et le 2-40 (
o ; 3 ; 15 mg Il) a été utilisé pour induire la formation de cals sur les explants et par la
suite la BAP (Benzyl amino-purine)
(1 et 2 mg/l) en présence de charbon actif (20g/l)
est ajoutée au milieu de base pour stimuler la formation d'embryons.
Ce premier essai ayant abouti à une organogénèse sans embryogénèse, nous avons
utilisé dans une deuxième série d'expérience, du 2-40 additionné de substances diverses
(hydrolysat de caséine (500 mg/l et 100 mg/l) et un mélange d'acides aminés ). Ce milieu

66
est appellé E-S. Aprés une phase de callogénèse, les cals sont placés sur milieu dépourvu
d'auxine mais contenant de l'hydrolysat de caséine (500 mgll et 100 mgll ) et un mélange
d'acides aminés, le saccharose est élevé à 40 gll ; l'agar (Bacto-Difco) est apporté à la
concentration de 5 gll et le 'charbon actif (20 gll) est ajouté stérilement au milieu de
culture. Le Ph est ajusté à 5.5 - 5.6 . Les cultures sont placées d'abord à l'étuve (25°C,
obscurité) pendant la première semaine puis à la lumiére sous une photopériode (16h/8h )
à 28°C.
2-3) Histologie
Les cals fragmentés en masse de 0,5 cm de diamètre sont fixés dans un mélange
fixateur le Nawaschine (Lison, 1960) pendant 24 h ; les cals sont inclus dans de la
paraffine. Les coupes sériées sont colorées à l'hematoxyline d'Heidenain puis montéees dans
du baume du Canada.
3- CULTURE DE RACINES EXCISÉES
3-1) Matériel végétal
Le matériel, constitué d'un premier lot de graines (Prov. 3157 N), et fourni par le CTFT de
Nogent sur Marne (France) et d'un second lot récolté sur des pieds situés dans le domaine de
la foire (Dakar). Les gousses étaient âgées de trois mois.
Les graines sont scarifiées à l'acide sulfurique concentré (98%) pendant 20 mn puis
abondamment rincées à l'eau de robinet.
3-2) Désinfection
Aprés un trempage d'une minute dans de l'éthanol 70% nous avons procédé à une première
désinfection de 4 mn dans de l'eau de javel commercial non diluée (12° chlore actif) suivi de
5 rinçages abondants à l'eau distillée stérile. A la suite d'une période d'imbibition de 30 mn,
les graines sont soumises à une seconde désinfection de 2 mn suivie de plusieurs rinçages à
l'eau distillée stérile.
3-3) germination
Les graines sont placées dans des germoirs contenant une couche de coton imbibée d'eau
distillée stérile et la germination s'effectue en salle de culture à la pénombre (30°C).
3-4) Mise en culture

67
Les segments de racines sont prélevés aseptiquement au bout de 3 à 4 jours aprés la
germination sur les jeunes plants. La racine est coupée à 2 mm au-dessous de l'hypocotyle et
à 2 mm de l'apex racinaire ; les segments de racines mesurant environ 1,5 cm sont cultivés
en boite de Pétri scellées au Parafilm sous une temperature constante de 25°C et une
lumière photopériodique de 16 h.
3-5) Milieux et conditions de culture
La croissance des racines latérales et le nombre de bourgeons formés sur les racines ont été
déterminés au bout de 30 et de 55 jours sur différents milieux de culture M-S Murashige et
Skoog (1962) ; Gamborg et aL, (B5)( 1968) ; Lloyd and Mc Cown (WPM) (1985); Bonner
et Devirian (BDA) (1939), contenant des substances de croissance et des vitamines de
Nitsch ~t Nitsch (1965)et en particulier la vitamine B12 (cyanocobalamine) indispensable
au bon développement des racines. Le
saccharose (30 g/I) et la gelrite (3,5 g/I) sont
ajoutés aux milieux.
Nous avons testé plusieurs hormones de croissance à diverses concentrations telles que les
cytokinines (BAP, 2iP, Kinétine, Zéatine), des polyamines (Spermine, Spermidine et
Putrescine) et une phényl-urée la 1-3 DPU et des auxines (A1A et AIB).
Les plants ont été acclimatés en serre sur un substrat fait d'un mélange de perlite et de
vermiculite (v/v) et réguliérement arrosés avec une solution nutritive de Hoagland et Arnon
(1938).
Les différents traitements ont été évalués sur la base de l'intensité de la
réponse à
l'organogénèse "in vitro" .
3-6) Histologie des bourgeons adventifs
Le matériel est constitué de racines coupées en fragments de 10 à 15 mm ; ces racines
prélevées 15 jours aprés la mise en culture, présentent des ébauches de néoformation
caractérisées par la présence d'un gonflement du tissu cortical sous-jacent au rhizoderme.
Les racines sont fixées dans un mélange de Glutaraldehyde (4%) / Cacodylate de Sodium
(0,2M) sous trompe à vide. L'inclusion se fait dans de la paraffine et les coupes sériées sont
réalisées au microtome (Reichert-Jung).
Les résulats sont analysés grâce à un logiciel de statistique qui permet d'effectuer des
analyses de variances (ANOVA) en comparant les moyennes et en déterminant les différences
significatives entre les traitements (test de Fischer, de Sheffé et Dunnett).
C) ETUDE DE LA SYMBIOSE FIXATRICE D'AZOTE ATMOSPHÉRIQUE

68
1) Matériel
végétal
Les graines d'Acacia albida (Provenance 3157N CTFT) sont scarifiées à l'acide sulfurique
98% pendant 20 mn. A la suite d'un rinçage abondant à l'eau de robinet, les graines sont
désinfectées à l'eau de javel pure pendant la mn. Aprés 3 rinçages à l'eau distillée stérile, la
première désinfection est suivie d'une période d'imbibition d'une heure. Une deuxième
désinfection survient plus courte que la précédente (3 mn). Aprés plusieurs rinçages, les
graines désinfectées sont placées dans des germoirs sur support de coton hydrophile imbibé
d'eau distillée. La germination s'effectue dans les 48 heures à la pénombre sous une
température de 2rc.
2) Influence de la richesse du substrat en éléments nutritifs
En testant la nature du substrat, le dispositif utilise deux types de sable en mélange avec de
la vermiculite (4v /1 v) :
- sable noir du jardin botanique contenant de la matière organique (SN)
- sable blanc siliceux de Cambérène depourvu de toute matière organique (CM).
Le tableau comparatif de la composition minérale des deux types de substrat est donné (Tabl
N° 1) .
Les 2 types de substrat ont été préalablement stérilisés au four Pasteur à 180 oc pendant 2
Heures.
L'inoculation a été effectuée aprés transplantation des semis dans des pots dès l'apparition de
la 2ème paire de feuilles, au moment où le système racinaire commence à se développer et à
initier des racines secondaires. Des souches ont été utilisées en mélange au moment de
l'inoculation: 43.6.3 ; 43.6.4; 45.6.1; 47.6.1; 45.6.2 et 47.6.1 (source MIRCEN de
l'Afrique de l'Ouest); ces souches sont spécifiques d'Acacia albida .
Le dispositif est le suivant:
- 2 traitements SN et CM avec 12 individus par répétition
- un traitement témoin non inoculé
Le substrat prélevé avant la mise en place de l'expérience et à la fin de celle-ci, a été analysé
par le laboratoire des sols du CNRA de Bambey où les échantillons ont été envoyés.
3) Influence des differentes souches sur la capacité de fixation d'azote
3-1)
Dispositif en serre

69
Nous avons testé 3 souches de Bradyrhizobium dont 2 isolées sur Acacia albida (47.6.4 et
45.6.1) et une isolée sur Acacia mangium (Baye IR), deux souches de Rhizobium à
croissance rapide dont l'une (PJ 12) a été
isolée sur Prosopis juliflora et l'autre (TAL
1405) sur Leucaena leucocephala .
Tabl N° 5: Origine des souches utilisées pour l'inoculation
Bradyrhizobium spp.
Plante-hôte
Source
Pays
d'origine
~ de souche
47.6:3
A. albida
(1)
Gueye (MIRCEN )
Senegal
47.6.4
A. albida
"id"
Senegal
45.6.1
A. albida
"id"
Senegal
Baye IR
A. mangium
(2)
Senegal
Rhizobium spp
~ de souche
Tai 1405
Leucaena leucocephala
(3)
Senegal
PJ 12
Prosopis juliflora
(4)
Senegal
(1) : Gueye M. : communication personnelle
(2) : Herridge D.F., Roughley R.J., (1975)
(3) : Halliday J., et Somasegaran P. (1984)
(4) : Diagne O. (Communication personnelle)
Ces 5 souches ont été inoculées à des plants d'Acacia albida âgés de 7 jours et cultivés en
serre sur un substrat et des conditions d'arrosage identiques au &3-2-1. Les résultats ont
été obtenus aprés 15 semaines de culture et concernent 20 individus.
3-2) Dispositif "in vitro" en tubes de culture
24 plantules agées de 3 jours, sont transférées en tube pour la phase ultérieure
d'inoculation.
Le dispositif "in vitro" de culture est constitué d'un tube en verre pyrex (22mm x 150mm)
contenant une motte MILCAP (Milcap France S.A Trementines) engainant une baguette de
verre creuse; à l'intérieur de la baguette, est introduit un ruban de papier filtre qui plonge

70
dans la solution nutritive et le liquide qui remonte par capillarité imprégne la motte MILCAP
sans la saturer .
La plante est cultivée sur la motte et son système racinaire est placé entre la paroi du tube et
la motte de façon à assurer la visibilité de l'ensemble du système racinaire au cours de sa
croissance. L'obturation du tube est effectuée par un bouchon en cellulose qui favorise les
échanges gazeux avec l'atmosphère ambiante.
Le milieu minéral liquide sur lequel est cultivée la plantule est celui de Broughton et
Dilworth (1 971 ) dilué du 1/4 sans azote dont le pH est ajusté à 6,7. Chaque tube de culture
reçoit une quantité de 20 ml de milieu de culture renouvelable au bout de 3 semaines. Le
dispositif est stérilisé à l'autoclave avant la mise en culture.
L'inoculation des plants est effectuée avec une culture pure de rhizobium en phase
exponentielle sur YEM liquide ( Vincent,1970) pendant 7 jours et contenant environ 109
bacté~ies par ml. 1 ml de la suspension bactérienne est déposé aseptiquement au contact de la
racine; la base du tube est recouverte d'un capuchon noir pour simuler l'absence de lumière
du sol. Une photopériode (16h /8h) et une intensité lumineuse de 50 lJE/m2ls déterminent
les conditions de la salle de culture.
4 ) Influence de l'ablation de l'apex racinaire
4-1) Dispositif en serre
Nous avons tenté de favoriser la rencontre entre la bactérie et la plante-hôte en augmentant
la biomasse racinaire par l'augmentation des ramifications secondaires aprés ablation du
méristème principal. A la suite de la germination et au cours de la première semaine de
croissance de la plantule, nous avons coupé l'apex racinaire et inoculé avec la souche 47.6.4
; la culture s'effectue sur un substrat et dans des conditions d'arrosage identiques au
paragraphe3-1.
4-2) Dispositif "in vitro"
Les plantules âgées de 3 jours, dont l'apex racinaire a été excisé, sont transférées en tube
pour la phase ultérieure d'inoculation.
Le dispositif "in vitro" de culture est identique à celui décrit au paragraphe 3-2.
5) Influence des reserves azotées cotylédonaires sur la
croissance initiale et sur la fixation biologique de l'azote
L'ablation des cotylédons intervient au moment de la mise en place des plants en serre.
Les plants ont subi 4 traitements différents:
1 : ablation totale des cotylédons et inoculation

71
2 : ablation partielle (1/2) des cotylédons et inoculation
3 : cotylédons entiers et inoculation
4: témoins non inoculés avec cotylédons entiers
5: plants inoculés entiers' addition d'azote starter 1,3 mMII de sulfate d'ammonium 7
jours aprés
l'inoculation
Le dispositif utilisé est constitué de deux pots en plastique superposés. Le vase supérieur (8
cm de 0) est rempli d'un mélange de substrat: perlite (8 vol) et aquastock (2 voL), un
hydro-retenteur constitué de cristaux de polyacrylamide. Le vase inférieur ( 6 cm de 0)
sert de réservoir de solution nutritive. Le liquide du 2ème pot remonte par capillarité grâce
à la présence d'une mèche de nylon qui relie les 2 pots. L'arrosage est régulier (1 fois par
semaine) avec le milieu de Broughton et Dilworth (1971 ) dilué du 1/4 sans azote.
6) Paramètres
mesurés
6-1) l'infectivité des souches
Elle est définie comme étant un critère qui teste la capacité d'un micro-organisme donné à
induire la formation de nodules sur une plante-hôte donnée. La mesure de l'infectivité se
base sur des critères de nombre et poids sec de nodules formés pendant une période donnée.
Le poids sec des nodules est obtenu aprés séchage des nodules à l'étuve (70°C) pendant une
semaine.
6- 2) L'effectivité
L'effectivité d'une souche de Rhizobium se traduit par l'augmentation de la croissance et de la
teneur en azote des plantes inoculées par rapport à des plantes non inoculées.
- Croissance
La hauteur totale de la partie aérienne est mesurée. La biomasse des parties aériennes et
racinaires est déterminée aprés séchage des échantillons (70°C) à l'étuve pendant une
semaine.
- Dosage de l'azote total
L'azote contenu dans les différentes parties de la plante (partie aérienne, partie racinaire,
nodules) a été dosé par la méthode Kjeldhal (Bremner, Mulvanet, 1982) .
Aprés avoir pulvérisé les parties préalablement séchées, un échantillon de 150 mg de chaque
plant est prélevé puis minéralisé dans des matras contenant Sml de H2S04 et 200 mg de
catalyseur à base sélénium. Le matras et son contenu sont portés à ébullition pendant environ
2h 30 mn sur les rampes de minéralisation. La minéralisation est terminée lorsque le
contenu du matras qui était coloré au départ devient translucide.

72
L'azote minéralisé sous une forme NH4+ est distillé. Le distillat recueilli sous forme
ammoniacal en présence d'indicateurs colorés (vert de bromocrésol 0,033% et rouge de
méthyle 0,066%) et d'acide borique est dosé par titration en présence d'H2S04 dilué du
1/4.
Le dosage d' 1mg de H2S04 correspond à 1 mg d'azote. La teneur en azote pour un échantillon
de 100 mg rapportée au poids sec total des différentes parties permet de déterminer la
quantité totale d'azote contenue dans chaque plante.
-Mesure de l'ARA
L'activité réductrice d'Acétylène (ARA) (Hardy et aL, 1968) est dosée par chromatographie
en phase gazeuse, à ionisation de flamme (DELSI, série 330) .
Les plants issus de culture de serre sont débarrasssés du substrat adhérant aux racines, la
plantule est coupée au niveau du collet et les racines sont enfermées hermétiquement dans
des flacons à sérum. 10% du volume d'air du flacon est prélevé puis remplacé par un volume
équivalent d'acétylène. L'incubation se fait pendant 30mn à température ambiante pour
permettre à la nitrogénase de réduire l'acetylène en éthylène. Au bout du temps d'incubation
des échantillons gazeux d'un ml sont prélevés à l'aide d'une micro-seringue puis injectés
dans la colonne. Le pic d'éthylène obtenu est fonction de la quantité d'acétylène produite par
l'enzyme. La quantité d'éthylène produite determine l'ARA, elle s'exprime en moles
d'éthylène produites par heure et par plante.
l'ARA spécifique ou SARA est déterminé par le rapport ARAl poids sec des nodules. Cette
valeur détermine l'activité nitrogénasique spécifique aux nodules.
7) Observation des premiers stades de "infection
Des jeunes plants d'Acacia albida sont inoculés avec une souche de Bradyrhizobium 47.6.4 ;
les prélevements ont été effectués 1°jours, et 15 jours aprés inoculation.
Les racines débarrassées du substrat, sont d'abord fixées dans un mélange de Glutaraldehyde
1 Cacodylate de sodium puis rincées dans le tampon cacodylate. Les racines sont décolorées
par une solution concentrée d'eau de javel (16°CI) pendant 4 heures sous vide partiel, suivi
de plusieurs rinçages à l'eau distillée. Elles sont colorées au bleu de méthylène (0.1 %)
pendant 5 minutes puis rincées à l'eau distillée pour éliminer l'excés de colorant.
Les observations se font au microscope optique en contraste de phase.

RESULTATS

BIOLOGIE DE LA
REPRODUCTION

Fig N° 3: Phénologie d'Àcacia al bide étudiée sur 2 populations (UNi et FOI) situées
dan:) la ré'Jionde [I;jl::ar nIA e.O\\).Q.~
cl.a. \\1~\\'\\l'te~
'~'31_ ,~~<.
3EPT
OCT
,JUl N
JUI LL
AOUT
Le::; parijrnètre::: phénolclI]ique::; (défeui11ai::;on, feuillaison, flor;ji$on, fructific;jtion et rfjatur;jtion) ::iont
qlj;'irItiflés en utilisflnt le::' critère::; ::,uivant:5;: 0= Atl::;ence tot;jle.; 1:: 25'% Ij';j bonda nce.; 2:: 50'i')
Ifabondance; 3= 75% d'abondance.; 4= 100% d'ijbondance.

74
Al BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION
') PHÉNOLOGIE
Tous les arbres étudiés sont localisés dans la région de Dakar; cependant la région de Dakar
bénéficie d'un microclimat trés particulier lié à l'influence de l'alizé maritime et les pieds
de Kad y sont généralement trés tardifs par rapport au centre du Sénègal. Nongonierma
('978) avait signalé ces décalages phénologiques ainsi que l'étalement dans le temps de la
floraison sur certains pieds situés en bordure de mer.
Nous avons suivi le cycle phénologique chez A. albida durant un an dans la zone d'étude; nous
avons pu constater que (Fig N°3) :
:- La feuillaison débute dés fin Octobre, l'optimum est situé ente Février et Avril et
les arbres sont totalement défeuillés à partir du mois de Juillet.
- La floraison débute au début du mois de Novembre pour se terminer au mois de Mai
avec un pic de floraison situé entre le mois de Février et le mois de Mars.
La floraison débute pratiquement en même temps que la feuillaison; le décalage entre
feuillaison et floraison ne dépassant pas 6 ou 7 jours; sur quelques pieds, nous avons même
pu constater que la floraison pouvait précèder la feuillaison.
Au sein des différentes populations étudiées, nous avons pu constater une grande variabilité
dans les stades phénologiques; les différentes phases sont trés étalées dans le temps; en effet
sur un même site, il est fréquent de trouver tous les stades depuis le début de la feuillaison à
la fructification .
D'autre part il n'est pas rare de trouver sur un même pied 2
stades phénologiques
concommitants, floraison et fructification.
Il est fréquent de constater que les branches situées face au vent (orientation NE) sont
beaucoup moins florifères que les branches situées à l'opposé (orientation SW) ; l'influence
du vent se fait nettement sentir dans cette zone où l'alizé maritime souffle en permanence
vers les côtes.
Généralement la floraison est relativement homogène sur la totalité du houppier qui ne se
trouve pas du côté du vent PI 2 fig A).
En outre, il a été constaté que certains arbres n'ont pas fleuri à cette période de l'année. En
effet, nous avons pu constater que sur un des sites (FOR), de nombreux arbres bien que
feuillés, n'avaient pas fleuri. Ces arbres se trouvent sur un sable dunaire tres pauvre en
bordure de mer (500 m de la côte). L'absence de floraison serait liée à une pluviométrie
insuffisante l'année précédant l'observation entraînant un abaissement du niveau de la nappe
phréatique. L'insuffisance ou l'absence de ressources en eau rendant la survie de la plante
difficile, seules quelques rares feuilles sont produites.

75
Ainsi, la diversité des stades phénologiques parait liée non seulement à des facteurs
endogènes intrinsèques propres aux individus mais aussi à des facteurs externes liés au
climat.
2) CARTOGRAPHIE DU RAMEAU INFLORESCENTIEL
Les rameaux inflorescentiels se développent au niveau des ramifications axillaires portant
de jeunes pousses de l'année en phase de croissance végétative. Nous avons constaté que la
plupart des rameaux inflorescentiels se trouvent en position terminale ou sub-terminale.
Les inflorescences sont terminales; cependant, nous avons observé au sein de la population
ORS (~ sur 50 cas observés) des inflorescences se terminant par un bourgeon végétatif à
fonctionnement plastochronique élaborant une pousse feuillée terminale.
Sur une quarantaine de rameaux secondaires portant des inflorescences, nous avons noté la
position des noeuds portant une ou plusieurs inflorescences.
La figure N°4 schématise la fréquence d'apparition des inflorescences sur les noeuds, en nous
basant sur leur position par rapport à l'axe principal.
Le nombre d'inflorescences formées est optimal entre le 7ème et le 24 ème noeud; c'est à ce
niveau que l'induction florale est maximale; sur les noeuds d'ordre inférieur (1 à 6) ou
supérieur (24 à 48), la fréquence et le nombre de fleurs formées sont réduits, au-delà du
48ème noeud on ne trouve plus d'inflorescence.
3) DYNAMIQUE DE LA FLORAISON
Elle est progressive et elle s'étale dans le temps sur une durée de 24 à 72 heures. Les fleurs
s'ouvrent de la base vers le sommet du rameau inflorescentiel (PI. 2 fig B).
Cette ouverture ne se réalise que lorsque les boutons floraux ont atteint une taille de 5 à 6
mm et que l'épi s'est allongé pour atteindre sa taille optimale d'environ 10 cm. Les fleurs
basales qui
arrivent à maturité plus tôt,
s'ouvrent les premiéres.
Elles sont
morphologiquement hermaphrodites au moment de la pollinisation avec un ovaire, un style et
un stigmate non atrophiés ainsi que des anthères normales.
L'ouverture des fleurs est aussi liée à leur position par rapport au soleil; elles s'ouvrent
généralement le matin et ce sont les fleurs situées face au soleil qui s'ouvrent les premiéres
avant celles opposées au soleil.Elles sont souvent butinées par les insectes (papillons et
guêpes) (pl. 2 fig C)
La plupart des fleurs situées à la base se déssèchent et tombent avant l'ouverture de la
totalité des fleurs de l'épi.

Fig }l" 4 : FréquertCes d' apparition des iIl1lürescertCes et du j,lOrabre d' a;œs inllürescentiels fümJfs en fonction du
numéro d' ordre des noeuds pris àp~Itir de la b~.se d' insertion dl), raJne(l.lJ. chez A. illbidi.1
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BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION CHEZ A. albida
PlANCHE W 2
Floraison chez A.
albida au mois de Février sur le site
FOI
Fig. A : A. albida en pleine floraison
~ : Dans les inflorescences en épi, l'ouverture des fleurs est
asynchrone et s'effectue de façon acropète.
Fig. C: La pollinisation se fait principalement par les insectes et en
particulier par les papillons et les guêpes.

A
B
c

76
4) MORPHOLOGIE FLORALE
4-1) Description de l'inflorescence
Les fleurs sont groupées en inflorescences sur un rameau axillaire ou terminal.
L'inflorescence, de couleur créme puis jaune à maturité, se développe toujours sur des axes
secondaires; c'est une inflorescence indéfinie de type épi portant des épines stipulaires
courtes.
Les caractères des organes floraux montrent une homogénéité dans le nombre total de fleurs
formées par inflorescence qui varie dans une faible mesure entre 75 et 120 (TabI.N°2); les
populations à l'exception de celle de HAN ne présentent pas de grande dissemblance.
Le nombre moyen d'inflorescences formées par rameau inflorescentiel est de 4,41. Les
boutons floraux ont une taille de 5 à 6 mm au moment de leur ouverture.
Le calice est légèrement pubescent et caduque aprés épanouissement de la fleur.
4-2) L'androcée et le gynécée
L'ovaire est infère avec un seul carpelle, mais nous avons observé des cas (2%) de fleurs
possèdant deux carpelles. Le style est long de 6 à 7 mm (PI. 3-fig A) et terminé par un
stigmate en forme de coupelle d'un diamètre de 150 pm en moyenne (Pl.3-fig B).
L'observation d'une coupe longitudinale du carpelle au microscope électronique à balayage a
permis de voir que les ovules sont situés sur deux rangées (PI.3 fig C) ; leur nombre varie
de 18 à 25 et ils sont de type campylotrope (PI. 4- fig A et B).
L'androcée est composée d'un nombre variable d'étamines soudées à leur base;
l'insertion du filet sur l'anthère est dorsifixe et la déhiscence de l'anthère s'effectue sur une
fente longitudinale (PI. 4 fig C). Le nombre de filets staminaux reste pratiquement constant
aussi bien entre individus éloignés qu'au niveau d'une même inflorescence (50 à 55) (Tabl.
N° 3); cependant nous avons eu un groupe d'individus où le nombre d'étamines est beaucoup
plus faible (32 ).
Le nombre total de grains de pollen produit par épi inflorescentiel est le produit du
nombre fleurs, du nombre d'anthères et du nombre de polyades par anthère qui est constant
(8). Cette quantité de pollen émise lors de la floraison rend compte de l'importance de
l'investissement mâle consenti par la plante au cours d'une période reprouductive. Cette
quantité varie de 46512 grains de pollen pour la population DAL à 24681 pour la population
ORS (Tabl. 6).

Tab!. N° 6: Caractères des organes floraux d'A. albida observés sur 5 sites du Sénégal en relation avec la
production de pollen
Population
Longueur (an) de
Nbre fleurs/
Nombre d'anthè
nbre total pollen/
l'épi inflorescentiel
inflorescence
res / fleur
inflorescence (a)
ORS
8,87
a
90,42
a
34,12 b
24681,04
UNI
8,5
a
87,51
a
52
a
36404,16
HAN
6,56
b
76,5
b
51,41 a
31462,92
DAL
10,08 a
110,6
a
52,3
a
46452
FOR
9,3
a
92,57
a
52,5
a
38879,4
(a) : Nombre total pollen émis par une inflorescence = Nbre total fleurs x nbre d'anthères x 8 polyades par
anthère
Tabl N° 7:
Nombre d'ovules par fleur et de monades par polyade observé chez 5
populations d'Acacia albida
Population
Nombre d'ovules /
Ratio monades/
Ratio polyade/ovule
carpelle
polyade
ORS
19,25 a
30,66
a
1,5
UNI
20,57 a
32,89
a
1,5
HAN
22,09 a
32,73
a
1,5
DAL
19,52 a
25,05
b
1,3
FOR
22
a
24,87
b
1,13

77
Le grain de pollen, est constitué chez A. albida d'un ensemble de monades agregées en
une polyade unique (PI. 4 fig D), dont le diamètre varie entre 80 et 100 #lm ; une polyade
chez A. albida est constituée de 2 à 3 couronnes de monades dont le nombre maximum observé
est de 36. Il existe une trés grande homogénéité entre individus au sein d'une même
population concernant le nombre de monades par polyade. Par contre, au niveau des
populations, nous avons identifié deux groupes de populations en fonction du nombre de
monades observées:
- les populations ORS UNI et Han ayant un nombre de monades élevé (32 à 36)
- les populations Dai et FOR avec un nombre de monades par polyade plus faible (28 à
30) .
La monade présente une éxine pratiquement lisse, finement grenue (PI. 4 fig D) .
Le rapport moyen du nombre de monades par polyade sur le nombre d'ovules par ovaire et de
l'ordre de 1,5 (Tabl. 7).
Des coupes ultra-fines du grain de pollen et l'observation au microscope électronique à
transmission, montrent que la paroi de la monade est structurée en deux enveloppes :
l'intine, l'exine (PI. 5 fig A , B et C).
- a) l'intine : elle constitue la couche la plus interne directement appliquée au
plasmaleme et elle est d'origine gamétophytique puisqu'elle est directement synthétisée par
la cellule gamétogène; elle est constituée d'une matrice opaque parcourue par de nombreuses
microfibrilles. Au niveau des pores d'aperture ou zones germinatives (PI. 5 fig C)la matrice
s'épaissit et contient des microtubules, des vésicules et des composés protéiques qui seront
mis à contribution au moment de la formation du tube pollinique.
- b) l'éxine située à l'extérieur par rapport à l'intine (PI. 5 fig B)est constituée d'un
matériel plus dense lamellaire formé par des dépôts successifs extra-cellulaires de
polymères de glucanes et d'esters de caroténoides : la sporopollenine. L'éxine est synthétisée
par les cellules de la paroi tapétale et par conséquent de nature sporophytique.
L'éxine est constituée de trois parties:
-une assise homogéne, continue constituée d'une concrétion de lamelles: la
néxine. Cette néxine perd son homogénéité et sa régularité au niveau des zones d'aperture où
les lamelles s'intercalent avec une matrice plus claire de nature différente polysacharidique
(Heslop-Harrison 1969); cette disposition lamellaire est clairement visible à la zone
d'aperture «PI. 5 fig C).
- une assise plus externe à la néxine : la séxine . Elle est plus hétérogène,
granullaire et contient de nombreuses vésicules et granules.
- le tectum

78
L'éxine est recouverte d'une épaisse paroi de cal/ose qui se forme trés tôt au moment de la
méiose et de la formation de la tétrade; cette callose s'hydrolyse en particulier dans les
espaces compris entre deux monades (PI. 5 fig A); par èontre, bien que réduite, elle persiste
à la partie externe et libre de chaque monade où elle constitue le tectum; elle a pour rôle
essentiellement de protéger la monade contre une dés§ication rapide.
Il faut remarquer que chez Acacia albida il n'existe pas de columelles au niveau de l'éxine.
Au moment de la maturation du grain de pollen, on note une série de modifications au
sein de la monade qui préfigurent son évolution ultérieure vers la germination. La cellule
végétative se déshydrate on observe de nombreuses vacuoles de trés petite taille qui occupent
la totalité du contenu cytoplasmique.
Le noyau végétatif (PI. 6 fig A)est constitué d'une masse homogéne, dense, allongée et trés
volumineuse. La cellule reproductrice ou cellule spermatogéne est multilobée (PI. 6 fig B),
allongée et est située au centre de la cellule végétative. Cette cellule spermatogéne est tout à
fait caractéristique, elle présente un aspect grèle et est multilobée. Elle se divise à la fin de
la maturation en deux cellules reproductrices spermatogénes (PI. 6 fig C).
5) ETUDE DE LA REPRODUCTION
5-1) Fructification
Les fleurs se fanent et tombent rapidement au bout de 72 heures; seules les fleurs fécondées
persistent sur le pédoncule floral; la chute des fleurs est progressive tout comme leur
ouverture; les premières à tomber sont celles situées à la base de l'épi puis c'est au tour des
fleurs du milieu et enfin de la partie supérieure.
Les fleurs fécondées sont reconnaissables par le style trés long qui demeure turgescent alors
que les organes de la fleur non fécondée sont rapidement fanés. L'infrutescence commence à ce
moment son développement, l'ovaire grossit devient chlorophyllien, les enveloppes
s'épaississent et de trés nombreux poils apparaissent sur toute la surface de la gousse en
formation. Les graines se développent à ('intérieur des téguments aprés que la gousse ait
atteint son stade ultime de croissance.
Nous avons constaté que les fleurs supérieures étaient plus portées vers la production de
fruits que les fleurs basales ( Tabl. W 8). La fréquence du nombre de gousses immatures
diminue progressivement de la partie apicale de l'épi vers sa partie basale.
On pourrait penser que l'épi présente une protandrie sur les premières fleurs formées et
situées à la base du pédoncule floral.
Ces fleurs joueraient plutôt un rôle attractif et
productrices de pollen. Les fleurs situées à l'extrêmité de l'inflorescence, par leur position,
sont favorisées pour recevoir du pollen provenant des autres arbres; elles se développent et

Tabl. N° 8 : Fréquences observées de la position relative des gousses immatures sur l'axe inflorescenciel
par rapport à la zone d'insertion de l'épi sur le rameau (observations effectuées sur 4 sites du Senegal).
Position des gousses sur l'axe inflorescentiel
Population
Distale
Médiane
Proximale
ORS
55%
33%
11%
UNIV
54%
31%
6%
HAN
72%
21 %
6%
FOI
58%
33%
8%
Tabl.N° 9 : Caractéristiques de la formation des fruits et des graines chez A. albida en relation avec le
nombre d'ovules contenus dans le carpelle (observations effectuées sur l'ensemble des arbres situés sur
les differents sites )
Population
Nombre de gousses/
nombre de graines /
Nombre d'owles /
déficit de
axe inflorescentiel
gousse (1)
carpelle (2)
remplissage du
carpelle
ORS
1,31
b
14,35
a
19,25
a
25,40%
UNI
1,1
b
14,25
a
20,57
a
30%
HAN
2
a
15,04
a
22,09
a
31%
DAL
1,29
b
15,3
a
19,52
a
21,60%
FOR
1,2
b
12,35
a
22
a
43,80%
Déficit de remplissage des carpelles = nbre d'ovules par caroelle(2) - Nbre de graines par carpelle (1)
nbre d'ovules par carpelle (2)

79
s'ouvrent plus tardivement que les fleurs basales; elles sont essentiellement destinées à la
fécondation.
Le nombre moyen de gousses matures qui sont unicarpellaires et indehiscentes qui se
forment par épi inflorescentiel est de 1,5 (Tabl. N° 9) et on trouve un maximum de 4
gousses par épi inflorescentiel. Le nombre de graines fomiées par gousses est aussi variable
; il varie de 8 à 25 avec une moyenne de 15 graines environ par gousse.
Chez les différentes populations d'Acacia albida étudiées, le rendement de la fécondation
estimé en termes de pourcentage de remplissage du carpelle est en moyenne de 70%. Ceci
rend compte d'un déficit de remplissage du carpelle qui est d'environ 30%. Le taux maximal
de remplissage observé est de 94,5%.
5-2) Réceptivité stigmatique
Les stigmates d'A. albida présentent une réceptivité décelable par la coloration rouge
caractéristique de la réaction enzymatique estérasique ( (PI. 7 fig A).
La période de réceptivité (Tabl. 10) débute au moment où les fleurs commencent à s'ouvrir
lorsque 80% des stigmates prennent une coloration rouge peu marquée et qui se limite à la
partie supérieure du style tout autour de la coupelle.
Au moment où les filets staminaux et les styles se délient et sont en extension, la réceptivité
est moyenne avec une coloration décelable sur environ 3 mm de longueur de style.
A l'ouverture des anthéres pour l'émission du pollen, 65,5% des stigmates sont intensément
colorés ; ici la coloration ne se limite pas à la partie supérieure du style, mais sur une
longueur plus importante de prés de 6 mm .
A la fin de l'anthèse, alors que les filets staminaux perdent leur turgescence, on constate que
85% des stigmates présentent une réceptivité maximale. La réaction se maintient bien que
moins importante (42%) jusqu'à ce que le style soit ramolli et que l'ensemble des pièces
florales soit fané.
Il apparait ainsi que la réceptivité stigmatique n'est pas limitée à la période de l'anthèse bien
qu'elle soit maximale à ce stade. En effet, elle se prolonge jusqu'à la fanaison puisqu'on
constate souvent que lorsque les anthères ont dégéneré, le style et le stigmate sont encore
turgescents pour quelques heures encore.
Les stigmates détendus un peu avant l'anthèse, exsudent un mucus abondant visible au
centre de la coupelle du stigmate, et qui est un adhésif puissant auquel les polyades viennent
s'accoler; le mucus est trés adhésif ce qui retient les grains de pollen même à la suite de
rinçages.

Tabl N° 10: Test de mise en évidence de la réceptivité stigmatique par la coloration rouge caractéristique
des estérases stigmatiques chez A. albida
Traitements
Nombre
Trés coloré %
peu coloré %
pas coloré %
A
24
0
50
50
B
32
0
83
17
C
45
51,80
48,2
0
D
40
65,5
31
3,5
E-
38
85
12
3
F
27
42
58
0
A = bouton floral de 5 mm
B = début d'ouverture de la fleur le stigmate étant encore replié à l'interieur
C = Ouverture de la fleur le stigmate émergeant de la masse des filets staminaux
D = Anthèse
E = Fin de l'anthèse début de la fanaison
F = dernières fleurs demeurées sur l'épi inflorescentiel aprés que toutes les autres se
soient fanées et présentant un style encore turgescent
Tabl. N° 11 : Pollinisation naturelle et nombre de polyades rencontrés sur les stigmates au moment de
l'ouverture de la fleur chez A. albida
Traitements
Nombre
% de stigmates
% de stigmates portant
portant des polyades
1 polyade
2polyades
3polyades '
C
45
12,5%
100%
D
40
61,50%
75%
25%
0%
E
38
76,90%
80%
16%
3,3%

J
,
80
Les polyades s'accrochent sur les stigmates sur la. face comme pour former un couvercle
mais aussi parfois sur un des bords de la polyade (PI. 7 fig B et D); et il n'est pas rare de
trouver 2 à 3 polyades accrochés sur un stigmate (PI. 7 fig C).
Nous avons déterminé la fréquence relative du nombre de polyades rencontrés sur les
stigmates au cours de la floraison (Tabl N° 11 )"
;
Au moment ou les filets staminaux sont en extension et se délient (tabl. 7), on observe trés
..
peu de polyades sur les stigmates; lorsque le pollen est éjecté et à la fin de l'anthèse on
observe respectivement 61,5% et 76,9% de stigmates portant des grains de pollen.
75 à 80% des stigmates ne portent qu'un seul grain de pollen, et 16 à 25% en portent 2.
5-3) QUALITE ET VIABILITE DU POLLEN D'A. albida
A)Tests FCR
La qualité et la viabilité du pollen ont été testés pendant 120 heures (5 jours aprés
prélevement). L'observation au microscope en épifluorescence montre des grains de pollen
présentant des degrés d'intensité d'émission de fluorescence. Nous avons distingué 3 grands
groupes : les monades à ihtense fluoresence, les monades à fluorescence moyenne et les
monades à fluorescence faible voire nulle. Les résultats sont rassemblés sur les figures N° 5
et 6.
- grains de pollen conservés à l'intérieur des pièces florales (fig N°S)
Aussitôt aprés prélevement des fleurs,
l'activité estérasique est trés intense sur
50% des monades alors que 31% ont une fluorescence moyenne; il est intéressant de noter
que 14% environ des monades sont morts dés l'ouverture de la fleur.
La viabilité
se maintient pendant 4 jours avec cependant une baisse de l'intensité ; la
plupart des monades (80%) conservent une activité moyenne et le nombre de monades
degénerés (24%) augmente avec le temps; 5 jours aprés la vitalité a baissé et seul 70 %
des monades présente une fluorescence moyenne.
- grains de pollen isolés des anthères (fig N°6)
Sur les grains de pollen isolés des anthères et placés dans des boites de Pétri à température
ambiante, la perte de viabilité survient trés rapidement au bout de 72 heures où seul 38%
des monades demeurent intactes. Au bout de 5 jours la quasi totalité des monades (93% ) a
dégéneré.
B) Germination "in vitro"

Fig. N" 5: Vkl.bilité du pollen d' A(";fâf ,tlt:.itdexpriiTlé en intensité de t1uorescence (test FCF:) en fonction de la. durée
de stod:ilg:e; les polyades ne sont pas libérés des &nttières.
Pollen Günser...-é
l'·r
"':".' 1~:~:
::~
....
100
fil
.;
D
~r
lluor b"\\l$ ù.t
l·.'
2
j
[ ]
FlINI" m,c.y
~
~
50
- 25
broie (I)
Fig. H' 6: Viabilité d1.1. pollen dl Al:Lll::.tl ,t/b.if'lexprimé en intensité de t1u.orescence (test FCR) en fonction de la. durée
de stockage; les polyades sont libérés des aILtrières et consel:vés ,1aIIS urIE: boite de péûi à température 8JJlbiBnte .
Pollen non conseivé
..... C'
.•••
"''''.'
1(10
......
~

81
B-l) Optimisation des conditions de germination "in vitro" .
B-l-l) développement du tube pollinique
Lorsque les conditions de culture sont favorable~, le pollen émet au niveau de la zone
d'aperture ou zone germinative constituée içi par une ligne de moindre résistance, un tube
pollinique (PI. 8 fig 1 et 2).
Le tube pollinique se développe sur le milieu solidifié par la gélose; il est constitué de trois
zones (PI. 8 fig.3)
- une zone proximale à cytoplasme trés dense contenant le noyau végétatif, les noyaux
reproducteurs et de trés nombreux organites (Z. a)
- une zone médiane moins dense et trés vacuolisée (Z.m)
- une zone distale claire et translucide (Z. d).
Le tube pollinique est entouré d'un manchon de substances qui, d'une part maintient la
turgescence nécessaire à la croissance du tube pollinique et d'àutre part, en secrétant des
enzymes, facilite la digestion de la gélose (PI. 8 fig 4).
Par ailleurs,
en plaçant l'extrémité du style à proximité des grains de pollen, on peut
constater une croissance polarisée des tubes qui se développent en direction du stigmate (
PI. 8 fig. 5 ).
B-2 )Influence de la composition minérale du milieu de culture
Nous avons effectué des éssais liminaires pour déterminer les conditions permettant
une germination du pollen d'A. albida. Il a tout d'abord été constaté que l'addition de bore (H3
B03 ) s'est révélée indispensable à une bonne germination des grains de pollen; en effet en
l'absence de bore, le taux de germination est de 3% et les tubes polliniques formés sont trés
courts et repliés sur eux-mêmes. De même nous avons constaté que la germination est
favorisée sur un milieu solidifié par le phytagel par rapport à l'agar (Bacto-Difco Agar).
Ensuite, nous avons cherché à optimiser ces milieux de culture pour la germination pollen.
En comparant deux milieux de culture (BK et GM) (voir Annexe pour la composition
minérale), le taux de germination le plus important est obtenu sur le milieu BK, le nombres
de monades germées équivalent au nombre de tubes polliniques est aussi plus élevé. Au bout
de 12 heures de culture les tubes atteignent une longueur moyenne de 334 J./m (Tabl N°12).
B-1-3) Influence de la concentration en saccharose
La germination du pollen et la croissance du tube pollinique chez la plupart des
espèces d'Acacia s'effectue en présence d'exsudats libérés au niveau du stigmate. Ces exsudats

Tabl. N° 12: Comparaison de deux milieux synthétiques B&K et GM en fonction de leur aptitude à favoriser
la germination "in vitro" des polyades, la formation et l'élongation des tubes polliniques d'A. albida
MILIEUX
Nbre polyades
% germination
nbre TP(*) par
longueur TP(*)
observées
polyade
(JJm)
BK
79
68,3
.7,32 a
334,2 a
GM
51
64,7
3,51 b
225,8 a
(*)T P : Tubes polliniques
Tabl. N°13: Influence de la concentration en saccharose sur la germination des polyades , le nombre et la
croissance des tubes polliniques(TP) d'A. albida cultivés sur milieu B&K (les résultats sont obtenus
aprés 12 h de culture)
Saccharose (g/I)
N total observ.
germés %
nbre TP(*) par
longueur TP(*)
polyade
(pm)
5
73
5,5
2,25 c
184,6 b
10
130
68,46
4,21 b
371,1 b
20
198
87,3
7,19 a
865 a
30
315
82,8
5,61 b
610,5 a
(*) T P : Tubes polliniques
Tabl N°14: Influence du pH sur la germination des polyades d'A. albida cultivés sur milieu BK
Ph
Nbre polyades
germés
non germés
pH 5
156
100%
0%
pH 6
143
100%
0%
pH 6,4
102
68%
33,87
pH 7
124
70%
30%
Tabl N° 15 : Germination du pollen d'A. albida et formation des tubes polliniques (TP) en fonction de la
durée de stockage des polyades dans les tissus de l'anthère
Temps aprés récolte
Oh
48 h
72h
96 h
120 h
N
39
55
46
36
32
% polyades germés
87%
85%
45%
39%
0%
Nbre TP* /polyade
12,43
12,55
7,19
5,61
0
Longueur TP(pm)
855
805
720
860
0
(*) T P = Tubes polliniques

82
contiennent entre autres éléments des sucres qui se sont avérés· indispensables à la
germination du pollen.
Le sucre contenu dans le milieu de culture doit se trouver en quantité optimale pour
favoriser la germination et le developpement des ~ubes et d'autre part établir un équilibre
osmotique adéquat à la réhydratation et à une bonne turgescence des cellules.
Plusieurs concentrations en saccharose ont été testées (tabl. N°13), les milieux contenant
20 g Il de saccharose stimulent favorablement la germination (87% de polyades germés) de
même que le nombre de tubes polliniques formés (7,19) et leur croissance dans le milieu
gélosé (865 pm). Les tubes atteignent une longueur maximale de 1500 pm.
B-1-4) Influence du pH du milieu de culture
Le milieu de base B-K additionné de 20g/1 de saccharose a été utilisé. Sur ce milieu de
base le pH a été ajusté à differentes valeurs (5, 6, 6,4 et 7) pour tester l'influence du pH
sur le pouvoir germinatif du pollen (Tabl. N° 14). nous avons constaté que l'optimum de
germination est obtenu aux pH acides, pH où la quasi totalité des polyades émet des tubes
polliniques. Le pH, en présence de 20 glL de saccharose, n'est limitant que lorsqu'il tend
vers l'alcalinité et dans ces conditions, les tubes polliniques émis sont souvent enroulés sur
eux-mêmes.
B-2) Test de la viabilité du pollen par la capacité de germination "in vitro"
Les tests fluorochromiques ont été couplés à des tests de germination in vitro" afin de
corroborer les résultats obtenus (Tabl. N°15). Le taux maximal de polyades en germination
(87 %) est obtenu
aussitôt aprés le prélévement des polyades. Le nombre de tubes
polliniques par polyade qui se développent au moment de la germination est en moyenne de 12
avec un maximum de 17 tubes. Au bout de 48 heures, le taux de germination par polyade
ainsi que le nombre de tubes polliniques formés par polyade ne varient pas. La durée de
stockage n'affecte les grains de pollen qu'à partir d'une période de 72 heures où on constate
une chute du taux de germination (41 %) et la réduction du nombre de tubes polliniques
formés (7,19).
5 jours aprés la date du prèlèvement, l'ensemble des grains de pollen a perdu la capacité à
germer. Il est intéressant de noter qu'en l'absence de facteur limitant lié au milieu de
culture, la durée de stockage n'affecte pas le développement des tubes polliniques dans le
milieu de culture ; en effet
l'allongement
des tubes polliniques
ne présente pas de
difference significative.

Tabl 13: Résultats des expériences de pollinisation controlée chez A. albida: détermination des rendements de la pollinisation au niveau
individuel et au niveau traitement
Arbre

UNIV
1
UNIV
2
UNIV
3
UNIV
4
UNIV
5
UNIV
9
F 7
F8
total
rendement
traitement
moyen par
traitement
nbre
épis
16
3
1 1
5
7
2
8
52
Témoins
auto
sans
nbre
gousses
4
0
0
0
0
1
1
6
manlpulat
rendements
0,25
0
0
0
0
0,5
0,125
0,125
Individuels
nbre
épis
7
4
4
3
6
3
6
33
Auto
poches
nbre
gousses
1
1
0
0
0
1
0
3
secouées
rendements
0,14
0,25
0
0
0
0,33
0
0,102
individuels
nbre
épis
7
7
16
4
3
3
4
44
Auto
fleurs
nbre
gousses
1
2
1
2
0
0
0
6
badigeonnées
rendements
0,14
0,28
0,06
0,5
0
0
0
0,136
Individuels
nbre
épis
6
13
9
3
2
5
5
3
4
50
Allo-pollinisation
nbre
gousses
3
8
1
0
3
6
3
1
0
25
rendements
0,5
0,61
0,11
0
1,5
1,2
0,6
0,33
0
0,538
Individuels
nbre
épis
16
7
6
9
14
3
5
13
5
63
pollln
naturelle
nbre
gousses
4
9
3
6
3
5
4
8
3
45
(Insectes)
rendements
0,25
1,28
0,5
0,66
0,26
1,66
0,8
0,61
0,6
0,735
Individuels

, ,
. (:
i-:
1
(.
83
5-4) Pollinisation contrôlée
Sur les arbres étudiés, aprés avoir procédé à l'ensachage des fleurs(PI. 9 fig A et B), au bout
de 3 à 4 jours, nous avons observé l'ouverture de là totalité des boutons floraux à "intérieur
des poches de fécondation. L'atmosphère ambiante à l'intérieur des poches n'inhibe pas
l'évolution normale des boutons en fleurs. Les sachets pollinisés ou non ont été récoltés, le
nombre de fleurs et les gousses en formation comptés.
a) Rendements obtenus à partir de l'expérience de la pollinisation
- rendements obtenus par traitement
Les témoins ensachés, n'ayant subi aucune manipulation ont produit des gousses (PI.
N° 9 fig C) avec un rendement de la pollinisation de 0,125 représentant 15% par rapport à
l'optimum obtenu dans le cas d'une pollinisation naturelle. Il est à noter que l'individu UNIV
1 a produit des
rendements relativement élevés (0,25) pour le traitement témoin ; les
inflorescences étant en grand nombre à l'intérieur de la poche, elles se trouvaient
pratiquement accolées les unes aux autres, et l'échange de pollen a pu se produire par cette
voie.
Les témoins ensachés qui n'ont pas été fécondés manuellement mais légèrement
secouées, ont produit des gousses avec un rendement sensiblement identique à celui obtenu
avec le témoin n'ayant subi aucune manipulation (0,102).
Lorsque la pollinisation est effectuée manuellement, en brossant les inflorescences
avec du pollen récolté sur le même arbre, on constate une légère augmentation du taux de
gousses formées (0,136).
Ces 3 premiers traitements ne donnent pas statistiquement des résultats significativement
différents (Tab!. N° 14).
Dans le cas d'une allo-fécondation (Tab!. N° 13), en brossant les inflorescences avec
du pollen récolté sur un autre arbre, les rendements obtenus (0,538) sont nettement
supérieurs à ceux obtenus dans le cas d'une auto-fécondation.
Lorsque ces rendements
sont comparés à ceux
obtenus dans le cas d'une pollinisation
naturelle, on constate qu'ils
sont légèrement inférieurs à ceux obtenus dans une
pollinisation naturelle par les insectes (0,7) .
La pollinisation naturelle donne un rendement optimal (0,735) considéré comme étant le
maximum de gousses obtenues dans les conditions naturelles chez A. albida .
- Rendements obtenus par individus

Tabl N°14 : Expérience de pollinisation contrôlée et naturelle chez A. albida: Analyse statistique des
données receuillies par traitement
Traitements
Nbre moyen d'épis
Nbre gousses obtenues
ensachés
par épis
Auto (sans manipulation)
7,42
0,429 a
Auto -fécond (poches secouées)
4,71
0,857 a
Auto -Fécond ( fleurs badigeonnées)
6,28
0,85 a
Allo-fécondation (fleurs badigeonnées)
5,55
2,77 b
Pollin naturelle (insectes)
8,66
5 b
Tabl. N°15 : Fécondations croisées chez A. albida : rendements de la pollinisation croisée
au niveau de chaque individu. Les rendements sont estimés par rapport au nombre total de
fleurs.
Populations
Croisements
Nbre inflor
Nbre fleurs
Nbre gousses
Rendement
male
x femelle
(a)
( b)
obtenues (c)
c/b
UNI
2 x 1
6
241
3
0,0124
UNI
1 x 2
8
363
4
0,011
UNI
1 x2
5
358
4
0,011
UNI
2
x3
5
256
UNI
1 x 3
4
178
°1
°
0,0056
UNI
5 x 4
3
110
UNI
1 x 5
2
93
°3
°
0,032
UNI
4
x5
5
162
6
0,037
UNI
4 x 9
5
185
3
0,0162
FOI
6 x 7
3
131
1
0,076
FOI
6
x8
4
94
°
°
Tab!. N° 16: Détermination de l'Index d'auto-incompatibilité (ISI)(d'aprés Zapata et Arroyo, 1978) au
niveau individuel et au niveau moyen de la population d'Acacia albida étudiée.
Arbre
UNIV
1
UNIV
2
UNIV
3
UNIV
4
UNIV
S
UNIV
9
F 7
F8

Rapports Auto/ Allo
0,14/0,5
0,28/0,61
0,06/0,11
0,5/0
0/1,5
0/0,6
0/0,33
0
151 individuels
0,28
0,45
0,54
0
0
0
0
0
Moyenne 151 au niveau population = moyenne Autol moyenne Allo = 0,136 1 0,538
0,25
donc auto-incompatibilité

84
Lorsqu'on considère les individus pris isolément (Tabl. N° 15), on constate que les
rendements des croisements contrôlés (déterminés en terme du nombre de gousses obtenues
par le nombre de fleurs fécondées par allo-pollinisation), varient en fonction des individus
de 0% (UNIV 3 et UNIV 4) à 3,7% (UNIV 5) ; sur les individus UNIV 3 et UNIV 5, quelle que
soit l'origine du pollen fourni, les rendements sont similaires.
Les meilleurs rendements ont été obtenus avec l'individu UNIV 5. L'arbre N°2 utilisé comme
géniteur mâle n'a pas produit de gousse sauf avec l'individu UNIV 1.
Nous avons aussi constaté que les performances sont en relation avec la taille et
l'envergure de l'arbre; la plupart des arbres qui donnent un fort rendement en gousses à la
suite de l'allo-fécondation, sont des arbres à cime large, avec une frondaison trés étalée, un
feuillage et une floraison abondantes (UINV1, UNIV 5 UNIV 9).
Ils sont généralement isolés sur un rayon 100 m et l'un UNIV 1 se développe dans une
dépression tres riche en matière humique.
Par contre les arbres qui forment un faible nombre de gousses (UNIV 2,UNIV 3, UNIV 4, FOI
7 FOI 8) sont de petite taille, présentent un feuillage épars et certains (FOI 7 et FOI 8)
poussent sur des sables dunaires tres pauvres.
b) Estimation de l'Index d'auto-incompatibilité (ISI)
L'index d'auto-incompatibilité (ISI) (Zappata et Arroyo (1978)), est le rapport entre le
nombre d'infrutescences ou de gousses obtenues a la suite de l'auto-fécondation sur le
nombre d'infrutescences obtenues aprés fécondation croisée.
En déterminant l'index d'auto-incompatibilité (ISI) chez Acacia albida,
lorsqu'on compare
les individus pris isolément, on constate une grande variabilité de l'ISI de °à 0,54 (tabl.
16) alors qu'il est en moyenne de 0,25 pour l'ensemble de la population étudiée.
D'aprés Kenrick et Knox lorsque l'ISI est compris entre ° et 0,2 l'espèce est auto-
incompatible; lorsque l'ISI est compris entre 0,2 et 1 l'espèce est partiellement auto-
incompatible, au delà de 1 l'espèce est totalement auto-compatible.
Il apparait d'aprés nos résultats qu'en considérant la moyenne obtenue au niveau de la
population étudiée, A. albida est une espèce auto-incompatible (0,25). Cependant il est
intéressant de noter qu'il éxiste une variabilité individuelle au sein de la population étudiée
révélée par une variabilité des
indices; certains individus peuvent présenter une auto-
compatibilité partielle (UNI2 et UNI 3 ) avec des indices plus élevés que la moyenne de la
population (respectivement
0,45 et 0,54 ). Mais nous n'avons pas observé d'individus
totalement compatibles (indice supérieur ou égal à 1) chez la population d'Acacia albida
étudiée.

85
6) DISCUSSIONS
6-1) Phénologie et dynamique de la floraison
La floraison chez Acacia albida est un phénomène présentant une certaine variabilité
liée d'une part au site et d'autre part dépendant du génotype de la plante puisque nous avons
pu constater des décalages phénologiques importants au sein de la population étudiée.
Le vent est un des facteurs défavorables de la floraison car la plupart des rameaux
situés sous le vent ne fleurissent que de façon exceptionnelle.
Généralement sur le rameau portant les inflorescences, l'induction florale est maximale
entre le-7ème et le 24ème noeud; en deça et au-delà, le nombre d'inflorescences induites et
formées est trés faible.
En étudiant la chronologie d'ouverture des fleurs, on a pu noter que les fleurs basales
s'ouvraient les premières ; il semblerait que leur rôle soit essentiellement d'offrir du
pollen pour attirer les insectes pollinisateurs qui se chargeront par la suite de polliniser les
stigmates. Ce phènoméne a été observé sur Acacia tortilis par Tybirk (1989). Les fleurs
médianes et surtout celles qui sont situées vers la partie extrême de l'épi inflorescentiel,
sont les fleurs les plus réceptives car c'est à ce niveau que le taux de fécondation est le plus
élevé ( 65 % pour les fleurs extrêmes, 25% pour les fleurs médianes et seulement 11 %
pour les fleurs basales).
Bien qu'il existe comme chez la plupart de Mimosacées, un certain taux de stérilité
femelle lié à l'atrophie du style ou de l'ovaire, en présence d'organes floraux parfaitement
fonctionnels, on peut noter une nette tendance vers la
protandrie au niveau des fleurs
basales alors que les fleurs supérieures sont en grande majorité protogynes.
Contrairement à ce qui a été rapporté par Guinet (1969) sur la morphologie des
monades d'A. albida, nous n'avons pas observé d'exine rugulée et aréolée caractéristique de la
tribu des Ingeae ainsi que la présence de columelles. Nos observations en microscopie
électronique à balayage et à transmission ont montré que l'exine des monades d'A. albida est
finement grenue et ne possède pas de columelles.
6-2) Structures reproductrices et stratégies reproductives
a) Rapport monade/ovule
Chez A. albida le rapport moyen monade/ ovule est de 1,5 alors que pour Acacia
nilotica le nombre de monade par polyade est identique au nombre d'ovules par ovaire; il
est de 16 (Tybirk,1989). Chez la plupart des Mimosacées et chez plusieurs espèces

86
d'Asclepiadacées, les rapports pollen/ovule sont géneralement trés faibles (1 à 1,5). Ce
rapport rend compte de l'efficacité du système de transport du pollen: plus ce rapport est
faible et plus le système de transport est efficace.
Chez les Mimosacées et les Asclepiadacées où les polyades sont présentes, le paquet
que constitue l'assemblage de monades en polyade, constitue un investissement minimal qui
est délivré au cours d'un seul voyage de l'insecte (Cruden, 1977) ; lorsque tous les grains
de pollen présents sont transférés simultanement sur le stigmate et fécondent
simultanément tous les ovules, le gain reproductif est maximum
et les ressources sont
utilisées de façon optimale.
Le
rapport moyen monade/ ovule de 1,5·, largement excédentaire en faveur des
grains -de pollen, rend compte de l'importance de l'investissement mâle par rapport à
l'investissement femelle. De même, la quantité de pollen émise lors d'une phase reproductive
renseigne sur l'importance de l'effort mâle fourni par la plante pour assurer la fécondation.
D'autre part if n'est pas rare de constater 2 à 3 polyades germant sur un pistil
unique, ce mécanisme permet de féconder la totalité des ovules du carpelle et d'assurer au
cours d'un seul événement pollinatoire la formation d'un maximum de graines.
b) Determination du systéme de reproduction (allogamie ou autogamie) par
les tests d e pollinisation controlée
Lorsqu'on compare les rendements obtenus au cours de l'auto-pollinisation, on
constate que les fleurs sur lesquelles le pollen est manuellement déposé, sont plus
fréquemment fécondées que les fleurs n'ayant pas subi de manipulation. En effet, on constate
une amélioration du rendement de la pollinisation lorsque le pollen est apporté au contact de
la fleur.
Ceci montre que pour assurer une pollinisation effective chez A. albida, il est nécessaire
d'apporter du pollen sur le stigmate; la mise en contact du pollen sur le stigmate par un
vecteur actif (manipulateur ou insecte pollinisateur), est indispensable à la fécondation;
comme l'a montré Tybirk (1993), sur de nombreuses espèces sahéliennes d'Acacia, la
pollinisation chez A. albida est essentiellement entomophile et s'effectue en particulier par
les papillons et les guêpes.
Nous avons constaté qu'il existe une différence dans les rendements obtenus à la suite de
l'allo-pollinisation entre la pollinisation naturelle par l'intermédiaire des insectes
vecteurs.
Cette différence de rendement observée entre l'allo-pollinisation contrôlée et la
pollinisation naturelle, rend compte de la perturbation occasionnée par l'ensachage. Bien que

87
les échanges gazeux et la lumière ne soient pas limités par Je sac transparent en gaze trés
fine, ce qui permet aux fleurs de s'épanouir normalement, par contre l'ensachage empêche
les principaux insectes pollinisateurs d'accéder aux inflorescences.
Ces insectes se
déplacent de fleurs en fleurs pour collecter du nectar et lors de leur passage le frottement de
leur abdomen et de leurs pattes avec les fleurs assurent une meilleure pollinisation que ne le
fait le manipulateur.
L'étude du mode de fécondation allogamie ou autogamie permet de connaître le mode
d'échange des génes à l'intérieur d'une même population et entre populations differentes ;
elle rend ainsi compte de la structure de la population.
Les différences trés significatives de rendements observées entre l'auto-pollinisation et
l'allo-pollinisation rendent compte de la pré-éminence d'un système de reproduction chez A.
albida où l'allogamie domine largement. Acacia albida ne fait pas exception à la régIe puisque
la plupart des essences forestières exploitées sont allogames ; cependant
on cite cependant
le cas exceptionnel de Leucaena leucocephala (Brewbaker,1983) qui est une des rares
espèces ligneuses tropicales autogames.
En outre l'auto-incompatibilité n'est pas totale chez A. albida puisqu'il a été noté des
individus présentant une auto-compatibilité partielle. Ces résultats viennent corroborer les
résultats obtenus par Joly, 1992 qui en étudiant les profils électrophorétiques de plusieurs
provenances d'A. albida de l'Afrique de l'Ouest, ont montré qu'il existe un déficit en
héterozygote, déficit qui s'expliquerait par un certain niveau d'autogamie chez cette espèce.
Comme "ont montré Kenrick et Knox, 1989 sur de nombreuses espèces australiennes, les
Acacia en général présentent une grande variabilité dans leurs systèmes de reproduction
allant de l'auto-incompatibilité stricte à l'auto-compatibilité la plus totale en passant par
des stades intermédiaires.
Le modèle proposé par Kenrick et Knox (1989 ) pour les Acacia en général, repose
sur un système d'auto-incompatibilité de type gamétophytique où co-existent un trés grand
nombre d'allèles dont certains sont post- zygotiques récessifs et létaux. Ce système d'auto-
incompatibilité favorise le maintien d'une grande hétérogéneité au sein des populations en
évitant la dépression dûe à la consanguinité; car lorsque les allèles post-zygotiques létaux
s'expriment, les embryons issus d'auto-fécondation avortent ce qui permet de privélégier et
d'assurer une descendance héterozygote à partir d'allofécondation.
Le fait constaté que le stigmate peut recevoir 2 à 3 polyades qui ne sont forcément
pas de la même origine, explique aussi en partie la variabilité observée dans les traitements
; en effet, lorsque plusieurs polyades germent sur un même stigmate, ce n'est plus la loi du
tout ou rien qui domine (auto-incompatibilité stricte) mais plutôt une gamme de réponses à
la fécondation liée à la présence de grains de pollen de differentes origines.

88
Nous avons aussi constaté que les performances estimées en terme de rendements individuels
de la fécondation varient avec les facteurs du milieu extérieur. La variabilité dans la réponse
à la pollinisation contrôlée et la liaison des performances en fruitaison avec les facteurs
intrinsèques et extrinsèques, corrobore l'hypothèse émise par Lloyd (1980) sur un
ajustement sérié de l'investissement maternel au cours d'une phase reproductive donnée. Il a
été démontré que le nombre de fruits formés est limité par la compétition pour les
ressources nutritives (photosynthétats et éléments inorganiques) entre les fruits en
croissance et les autres organes de la plante (Lloyd, 1980) ; il a aussi été démontré que la
quantité de fruits produite par un individu donné est dépendante de la taille, de la biomasse,
du nombre de nœuds ou du poids des feuilles de l'individu.
6-3) Effort reproductif et aptitude des deux partenaires à la reproduction
a) effort reproductif
Le taux de
fécondation au niveau d'une inflorescence est faible car il dépasse
rarement 1,25 %; les pertes sont considérables car 98,75 % des fleurs se déssèchent et ne
donnent jamais de fruits. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus sur differentes
espèces d'Acacia australiens où environ 1% des fleurs
produisent des fruits (Milton et
al.,198l).
Le nombre de graines par gousses dépasse rarement 25 ce qui constitue le nombre
maximal d'ovules rencontrés dans un ovaire. Ces valeurs sont trés élevées par rapport aux
autres espèces africaines du même genre (Kenrick et Knox, 1989) et en cela A. albida se
rapproche beaucoup plus des membres de la tribu des Ingeae.
Il appparait par ailleurs, que le caractère du nombre d'ovules par carpelle est sous
contrôle génétique et par là, limite le nombre de graines.
Nous avions pu constater que chez Acacia albida, dans les conditions naturelles sur une
moyenne de 32 monades moins de la moitié (44%) atteignent et fécondent les ovules; avec
une moyenne de 20,31 ovules par carpelle le pourcentage de remplissage du carpelle varie
autour de 70% si on exclut les fécondations avortées.
Le déficit de remplissage du carpelle montre que malgré l'effort mâle fourni au
niveau de la fleur, tous les ovules d'un carpelle ne sont pas fécondés.
b) Réceptivité stigmatique
Il existe un léger décalage entre l'ouverture des anthères et la réceptivité du stigmate
d'A. albida; en effet si la réceptivité débute rééllement au moment de l'anthèse elle atteint

89
son optimum aprés l'éjection de pollen pour décroître lorsque les pièces florales sont
totalement fanées.
Contrairement aux espèces australiennes d'Acacia qui produisent un exsudat liquide sucré au
moment où le stigmate est le plus réceptif, chez A. albida , nous n'avons pas observé ce type
de réaction; nous n'avons pas non plus constaté la présence de cuticule comme cela a été
rapporté chez les Papillionacées (ex: Trifolium, Heslop-Harrison et Heslop-Harrison,
1983).
Par contre nous avons observé la présence d'une substance adhésive à la partie supérieure du
stigmate qui permet aux grains de pollen de s'accrocher solidement sur un des bords à la
surface du stigmate.
c) qualité du pollen
Nous avons remarqué que toutes les monades d'un polyade d'A. albida ne sont pas
viables. Le taux maximal de viabilité est de 85%. Chez A. retinodes (Kenrick et Knox, 1985)
seul 70% des monades sont viables ; ceci pourrait s'expliquer par un stress lié à
l'environnement, l'âge de la fleur, et à un ensemble de facteurs génétiques propres à l'espèce.
Les grains de pollen libérés des anthères déhiscentes sont transportés par le vent. Au
moment où le pollen arrive en contact avec le stigmate, il peut se dérouler un temps assez
long; au cours de cette période le pollen se déshydrate et perd une partie de ses facultés
germinatives.
En culture, le pollen deshydraté d'A. albida perd en 3 jours ses facultés germinatives. Par
contre lorsqu'il est protégé de la dessication par les tissus floraux, ses pertes en eau sont
réduites et son pouvoir germinatif est conservé pendant au moins 5 jours.
Les tests de germination "in vitro" couplés avec le test fluorochromique ont montré
chez A. albida qu'ils sont fiables et comme l'ont montré
Heslop-Harrison et al.,
(1984)peuvent fournir une information adéquate sur la qualité du pollen qu'on va utiliser
pour effectuer des fécondations croisées.
Cependant, ces deux test FCR et germination "in vitro" doivent être utilisés en
complémentarité.
En effet, si le test FCR est un test qui détecte l'intégrité de la membrane plasmique et donc
la possibilité pour la cellule de pouvoir fonctionner normalement, il a
tendance à
surestimer la qualité du pollen; alors que le pouvoir de germer et d'émettre un tube
pollinique constitue une base plus réaliste pour évaluer les performances du pollen, bien
que ce test biologique soit soumis à de nombreuses limitations (composition du milieu et
conditions de culture et possibilité d'interaction du pollen avec le stigmate ).

90
L'utilisation
couplée des tests de germination à des méthodes indirectes histochimiques
basées sur l'activité de certaines enzymes
(FeR,
tri-phenyl tetrazolium etc ... ) devrait
permettre d'accéder à un niveau de réponse sur la viabilité trés satisfaisant.
Nous avions aussi constaté que tous les ovules d'un carpelle ne sont pas fécondés au
cours d'un événement pollinatoire. L'absence de fécondation de la totalité des ovules contenus
à l'intérieur du carpelle pourrait être expliquée par la perte de viabilité des monades au
cours du transport et le défaut de germination de la totalité des monades.
En effet lorsqu'on sait que seuls 85% des monades sont viables et qu'en moyenne 12,5
monades sont capables de germer et d'émettre un tube pollinique, on comprend dés lors que la
totalité des ovules (20 en moyenne) contenus dans une loge carpellaire ne pourront pas être
fécond.és. Le degré de receptivité ovulaire est un facteur critique de l'évaluation de la
fécondité (Dumas et Knox 1983).
Des études complémentaires plus détaillées "in vivo" et "in vitro" sur les conditions de
germination des monades, sur la cytologie de la croissance du tube pollinique à l'intérieur du
style et sur les premières étapes du développement embryonnaire au sein de l'ovaire sont
nécessaires pour appréhender le processus de la fécondation adopté chez Acacia albida.

PlANCHE ND 3
Obse-rvations du gynécée d'A. albida en
microscopie
électronique
à
balayage
Fig. A : Pistil d'A. albida isolé des pièces florales et constitué de
l'ovaire (ov), du style( st) et du stigmate (sg) (Gr x720)
Fig. B: Détail du stigmate qui se présente sous la forme d'une coupelle
noter l'absence de papilles stigmatiques (Gr x4800).
Fig. C : Coupe longitudinale de la cavité ovarienne; les ovules sont sur
deux rangées, de part et d'autre de la ligne de suture du
carpelle (Gr x1200).( ov: ovule; Pc: paroi carpellaire)

(Dr
B

Planche W 4
Organes
reproducteurs d'A. albida observés en microscopie
électronique à balayage
Fig. A : Détail de la rangée d'ovules (Grx2000).
Fig. B : Ovule d'A. albida de type campylotrope; on distingue les
téguments interne et externe et le tissu nucellaire (Gr x4800).
fuh....G.-: Anthère déhiscente d'A. albida constituée de deux lobes, chaque
lobe est divisé en deux loges dont chacune contient deux polyades
(Gr x 2200).
Fig. D : Organisation d'un grain de pollen: constitué de monades
1
agrégées en une polyade unique; la surface des monades est
finement grenue; noter les dépressions latérales (fléches)
représentant les pores germinatifs (Gr x7800).


Planche W
5
Organisation structurale de la monade d'A. albida
Fig. A : Aspect général de la structure d'une monade en coupe
transversale (Nr: Noyau reproducteur; Nv : noyau végétatif; Pg pore
germinatif) (Gr x8000).
~: Détail de la structure des parois de la monade
( C: cytoplasme; ln: intine ; Nx: néxine lamellaire; Sx: séxine
granuleux; t: tectum présentant des zones de lyse ( )); noter
l'absence de columelles au niveau de l'éxine (Gr x28000).
Fig C: Détail d'un pore germinatif; noter la structure de la néxine
composée de lamelles de sporopollénine qui perdent leur homogénéité au
niveau du pore germinatif. Noter aussi l'absence de séxine et de tectum
au niveau de la zone d'aperture, l'épaississement de l'intine et la
présence de nombreuses inclusions allongées (
) et des substances
qui vont participer à la formation de la paroi du futur tube pollinique
ln: intine ; Nx: néxine lamellaire (Gr x20000).

J
A
f

.:,
B
c

Planche W
6
Ultrastructure de la monade d'A. albida
Fig. A : Détail du noyau végétatif (Nv) (Gr x 20000).
fuL..-..6. : Détail du noyau reproducteur Nr (Gr xl 0000).
Fig. C : Division du noyau reproducteur en deux pour donner à la
fin de la maturation du grain de pollen, deux cellules spermatogénes
(Cs1: Cellule spermatogéne 1; Cs2: Cellule spermatogéne 2) ;
noter qu'au niveau de la zone d'aperture, le réseau de lamelles devient
plus lâche. (Gr x4800).

A
'\\
.,~
B
c

Planche N° 7
Réceptivité du stigmate d'A. albida
Fig A: : Réaction estérasique caractéristique de la
réceptivité stigmatique à divers stades de
développement du pistil en
fonction de l'âge de la fleur; l'intensité de la réaction est déterminée
par le degré de coloration des styles et stigmates. Nous avons choisi les
fleurs à différents stades de développement ( Gr. x125)
A: bouton floral de 5 mm
B : début d'ouverture de la fleur
C : ouverture de la fleur le stigmate émergeant de la masse
des filets staminaux
D: anthèse
E : fin de l'anthèse début de la fanaison
F : fleurs demeurées sur l'épi inflorescentiel aprés que
toutes les autres se soient fanées et présentant un style
encore turgescent
_
Fig. B : Polyade accrochée sur le stigmate par le bord; ce cas
est trés courant (P : Polyade ; 5g : stigmate). (G.r. x 125)
Fig. C : Polyade adhérant sur sa face plate à la partie supérieure du
stigmate (P : Polyade 5g : stigmate). (Gr. x 125)
Fig. D: Deux polyades accrochés sur un même stigmate. (Gr. x 150)

A
:E
B
o

Planche ND 8
Germination "in vitro du
pollen d'A.
albida
Fig. A : Polyade en cours de germination observé au microscope
électronique à balayage (Gr. x 6000)
Ei.a.J!: Polyades (Photo prise 4 heures aprés prélevement)
germant sur milieu Brewbaker et Kwacks (1975) et
présentant de nombreux tubes polliniques qui s'allongent bien dans le
milieu de culture (Gr. xl00)
Fig. C : Déploiement du tube pollinique dans le milieu optimal de
culture on distingue 3 zones (Gr. 250):
- une zone apicale (z.a) à cytoplasme dense contenant le noyau
végétatif, les noyaux reproducteurs et de trés nombreux organites
- une zone médiane (z.m) moins dense et trés vacuolisée
- une zone distale (z.d) claire et translucide
Fig. D : Croissance polarisée des tubes polliniques en direction du
stigmate (Gr. x 50) (s.a ~ s""'8r1\\"'~
. '!: ?o\\~~d.e..')
Fig. E: L'extrêmité du tube pollinique est entourée d'un manchon de
substances sécrétées par le tube pollinique qui maintiendrait la
turgescence de l'extrémité du tube tout en favorisant sa
progression grâce à la digestion enzymatique du milieu nutritif gélosé
(Gr x 400) . (c.: c~\\.LO~Q.)

A
B
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.
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1
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- - - - - - - - -
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E
o
co

MICROPROPAGATION
VÉGÉTATIVE IN VITRO

92
B)MULTIPLICATION VÉGÉTATIVE "IN VITRO"
1)MICROPROPAGATION "in vitro" par culture de nœuds axillaires
1-1) Influence de la saison sur l'expression morphogène des explants
Les prélévements du matériel végétal ont été effectués à différentes époques de l'année sur
les mêmes arbres pour déterminer les périodes les plus favorables à une bonne reprise de
croissance des explants mis en culture (Fig.N°?).
Èn considérant le nombre d'explants primaires qui ont débourré (1), on constate une
nette évolution entre les differents mois de l'année.
L'optimum de débourrement est obtenu durant les mois de Décembre, Janvier Février et
Mars où pratiquement sur 100% des explants, les bourgeons débourrent. Pendant les mois
allant de Juin à Octobre, on n'observe aucun signe de débourrement sur les ex plants
primaires. A partir du mois de Novembre, les ex plants commencent à réagir à la culture "in
vitro" et à élaborer des pousses feuillées. Il est à noter que durant le mois d'Août, mois
particulièrement pluvieux, le taux de débourrement est nettement augmenté par rapport aux
mois précédent et suivant.
Par rapport à la caulogénèse, nous avons pu constater que la période allant du mois de
Février au mois de Mai est la plus propice à une bonne organogénèse "in vitro" ; le maximum
de réactivité se situant durant le mois de Février - Mars.
Durant la saison hivernale, la caulogénèse est pratiquement absente.
1-2) Influence de differents facteurs susceptibles d'ameliorer la
reprise de
croissance du matériel végétal
1-2-1) Réduction de l'oxydation de polyphénols
Chez les arbres âgés, certaines substances come les polyphénols sont accumulés dans
les tissus et par leur action inhibitrice sur la croissance et la morphogénèse, ils peuvent
rendre les organes mis en culture peu réactifs ; parfois un simple trempage dans une
solution aqueuse avant l'introduction "in vitro",
permet de libérer l'expiant de l'action de
ces substances inhibitrices.
Il apparait que dans le milieu M-S avec ou sans les oligo-éléments, l'importance de
la concentration molaire entraîne une plasmolyse rapide aprés seulement quelques heures de
trempage; le déssèchement débute à la partie apicale puis gagne la tige en entier. Le milieu

Fig. 7 : In11uence de ia période de l'a.vmée sur l'expression des potenti3Ji1:és morphogénètiqlJ.es "in '.ri.tro" d'expkmt5
issus lie dr~eons diA. al!liIfL~arl.ulte.
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125 _ ..
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100 - ..:

93
MS 12 contenant des ions nitrate comme source azotée permet une survie limitée de la tige
feuillée à 2 jours (tabI.20).
La dilution de cette solution minérale par deux avec comme source azotée des ions NH4+1
favorise un bon maintien des tissus de la tigelle
pendant au moins 3 jours. Seul un pré-
trempage dans de l'eau distillée permet de maintenir les tissus parfaitement intacts pendant
une durée qui dépasse 3 jours. 5 jours aprés le trempage dans l'eau, on obtient encore 75%
des tiges qui sont trés vertes et turgescentes.
Il est apparu que dans les tissus adultes même rajeunis partiellement, subsistent quelques
substances inhibitrices de la croissance de type polyphénols. D'autre part, il a été demontré
que l'azote à forte concentration dans le milieu pouvait avoir un effet inhibiteur. Ce test
préliminaire a montré que le trempage de la tige dans de l'eau distillée (tabl. 21) permet de
conserver en bon état les différents tissus de la plante tout en favorisant la libération de
substances toxiques.
(1 )le débourrement est considéré ici comme l'étape initiale où le bourgeon gonflé s'ouvre et dévoile les premières ébauches de
feuilles. alors que la caulogénèse constitue l'étape suivante au cours de laquelle le bourgeon débourré s'allonge en tige feuillée)

Tabl. N°20 : Influence du pré-trempage dans differentes solutions salines sur l'état physiologique des
rameaux feuillés d'A. albida
M-S
M-S - oligo-Elmts
M-S + N03
M-S+ NH4
M-S sans N
EAU Distill
durée de
état
N=10
N=13
N=12
N-l0
N=12
N=10
trempage
physiol
1
0
0
100%
100%
100%
100%
24 h
2
50%
23%
0%
0%
0%
0%
3
50%
77%
0%
0%
0%
0%
48 h
1
0%
0
0
100%
100%
100%
2
0%
0
50%
0%
0
0
3
100
100%
50%
0%
0
0
0%
72h
1
0%
0%
0%
100%
50%
100%
2
0%
0%
0%
50%
0
3
100
100%
100%
0%
0
0
120h
1
0%
0%
0%
50%
50%
75%
2
0%
0%
0%
50%
50%
25%
3
100
100%
100%
0%
0
0%
N: Nombre total de rameaux feuillés observés
Etat physiologique 1: rameau feuillé intact vert et turgescent
2 : rameau feuillé partiellement desseché sur l'apex
3 : rameau feuillé totalement désseché sur toute sa longueur
Tabl. N° 21: Expression morphogénétique des nœuds d'A. albida pré-traités par trempage dans de l'eau
distillée et dans le mileu M-S + NH4 pendant 120 heures et cultivés "in vitro" sur milieu M-S. Les
résultats sont obtenus aprés 4 semaines
Traitements
Nbre total
Débourrement
Explants caulogènes
explants
Nbre
%
Nbre
%
M-S +NH4
24
16124
67,6%
7/24
29%
Eau distillée
24
18124
75%
9/24
36%

Tabl. N°22 : Influence de l'origine du matériel végétal sur la morphogénèse "in vitro" d'explants d'A.
albida cultivés pendant 4 semaines sur milieu M-S .
Type de matériel
taux de survie
débourrement bg axill
croissance pousse feuil
nbre
%
nbre
%
nbre
%
drageons
15/24
62,5
18/24
75
16/24
66.6
rejets
9/18
50
7/18
39
0/18
. 0
pousse florifère
15/24
75
o
0
o
0
Tabl.N° 23 : Influence de l'obturation du tube de culture sur la morphogénèse "in vitro" d'explants d'A.
albida cûltivés sur milieu M-S aprés 47 jours de culture
type
N
Infections
caulogenese
enracinement
d'obturation
Nbre
%
Nbre
%
Nbre
%
boumon cellulose
96
50/96
52,07 53/96
55,7
24/96
25
bouchon acier inox
96
62/96
64,5 47/96
48,9
14/96
14,90
Tabl.24 : Influence de l'obturation du tube de culture sur la morphogénèse "in vitro" et l'élongation
o'explants d'A. albida cultivés sur milieu M-S aprés 21,34 et 47 jours de culture
type
N
nbre folioles
élongation
d'obturation
à 47 jours
21 jours
34 jours
47 jours
boumon cellulose
96
2,5
3,77
5,1
7,45
bouchon acier inox
96
1,83
2,83
4,3
6,5
Tabl. 2S : influence de la présence ou non du charbon actif sur la morphogénèse "in vitro" d'explants issus
de drageons d'A. albida cultivés pendant 30 jours sur milieu M-S
Traitements
explants avec feuilles
explants caulogenes
Longueur des tigelles à
Nbre
%
nbre
%
jours 30 jours (mm)
MS + O1arbon
34/48
70,8
14/48
29
8,88 a
MS - charbon
37/48
77
11/48
22,9
8,74 a

94
1-2-2) Influence de la nature du matériel végétal
Des essais de mise en culture sur un milieu de base M-S, de différents types de
matériel végétal, drageons, rejets et pousses florifères, (PI N° 10 fig A, B et C) ont montré
que seuls les drageons prélevés à proximité· du système racinaire permettent un
débourrement du méristème axillaire.
En effet, (tabI.22) les explants prélevés sur des drageons ont un pourcentage de reprise
élevé (75%), et 66% d'entre eux produisent des axes feuillés qui évoluent en tigelles par
allongement. La proximité des drageons avec le système racinaire favorise l'expression de la
caulogénèse grâce à un environnement nutritionnel et hormonal bénéfiques.
En utilisant des rejets récoltés sur les troncs (pousses épicormiques) ou bien
récoltés sur des souches, on constate que le pourcentage de reprise de l'activité
méristématique est trés faible. La plupart des nœuds forment exclusivement des feuilles à la
place des tiges; le bourgeon demeure bloqué sans pouvoir évoluer en tigelle.
Par contre les pousses prélevées au niveau de la cime au moment où l'arbre fleurit,
ne débourrent pas, aucune réaction morphogénétique n'est observée sur ce type d'expiant.
1-2-3) Influence du mode d'obturation des tubes
La micropropagation "in vitro" est généralement tributaire des conditions physiques
du milieu
de culture. Parmi celles-ci, l'aération des tubes qui permet et favorise les
échanges gazeux entre le tube et l'atmosphère ambiante semble être un facteur essentiel.
Lorsque les échanges gazeux se font librement, le développement se trouve facilité, par
contre lorsqu'il y'a accumulation de certains gaz (tels que le C02 ou l'éthylène) sans que le
renouvellement puisse se faire, la conséquence est le ralentissement de la croissance de
l'expiant.
Pour cette raison, nous avons comparé l'influence de 2 types d'obturation sur la
morphogénèse d'explants d'A. albida cultivés sur un milieu M-S; les bouchons sont de deux
types:
- des bouchons en cellulose
- des bouchons en acier inoxydable (type Bellco)
Les résultats sont présentés sur les tableaux N° 23 et 24.
Nous avons
constaté un effet significatif de l'obturation sur le
développement et la
croissance des explants.
En effet l'expression de' la morphogénèse "in vitro" (caulogénèse, élongation des
tigelles, nombre de pinnules formés, enracinement des tigelles) est accrûe lorsque les
bouchons en cellulose où les échanges gazeux sont plus importants sont utilisés.

Tabl. N° 26: Influence de 4 milieux de base sur l'expression morpho génétique du bourgeonnement axillaire
d'explants d'A. albida aprés 47 jours de culture
MILIEU
Nbre
taux de survie
Formation de feuilles sans
croissance en pousses
initial
élongation
feuillées
nbre
%
nbre
%
nbre
%
Q-L
48
27/48
56,25%
16127
59,2%
11/27
40,7%
M-S
48
23/48
48%
8123
34,70%
15/23
65.2%
GM
48
31/48
64,50%
18/31
58,06%
13/31
41,90%
N-N
48
31/48
64,50%
2131
6%
18/31
58%
Tabl. N° 27: Elongation des tigelles formées à partir d'explants d'A. albida sur 4 milieux de culture en
fonction de la durée de la culture
1 MILIEUX
Longueur des tigelles (mm)
Durée de la culture
21 jours
34 jours
47 jours
Q-L
4,7 a
5,1 b
7b
M-S
4.1 a
7,6 a
10.6 a
N-N
3.6 a
5.9 b
9a
GM
2.7 b
3.1 c
5.2 c
Tabl N°28 : Influence de 4 milieux de base sur la survie et la morphologie foliaire de tigelles formées à
partir d'explants d'A. albida apres 47 jours de culture
Milieu Nbre initial
chute des feuilles
nbre pinnules
Morphologie des feuilles 1
Nbre
%
Q-L
48
10127
37
1,8 b
feuilles chlorosées et de
petite taille
M-S
48
2123
8,6
2,8 a
feuilles trés chlorophyliennes
grandes bien étalées
GM
48
18/31
58
2,3 a
feuilles petites peu étalées
N-N
48
7/31
22,5
2,4 a
feuilles vertes bien étalées
Tabl. N° 29: Influence de la dilution des macro et des micro-éléments de MS sur l'expression
morphogénétique d'explants d'A. albida aprés 4 semaines de culture.
MILIEUX expiant avec feuille
expiant avec tiges
expiant callogène
expiant sans réaction
sans axe de ti e
feuillées
nbre
%
nbre
%
nbre
%
nbre
%
M-S
1/18
5,5
14 /18
77,7
0
0
3/18
16,6
M-S/2
3/18
16,6
10/18
57
3/18
16
5/18
27
M-S/5
0/20
0
2 /20
4120
20
14120
70
M-S/10
0/18
0
1/18
0,5
2118
11
15/18
83,5

9S
Du point de vue de l'élongation (Tab!. N°24) bien que la vitesse de croissance des explants
soit la même dans les deux traitements, il subsiste un léger avantage lié à l'obturation par
les bouchons en cellulose.
. 1-2-4) Influence du charbon actif sur la caulogénèse
L'addition du charbon actif permet d'améliorer légèrement le taux de caulogénèse ;
par contre son apport dans le milieu de culture n'a pas d'effet significatif sur l'allongement
des bourgeons formés par rapport à un milieu sans charbon actif; cependant la présence de
charbon actif permet une amélioration qualitative au niveau aspect des pousses feuillées qui
sont plus vigoureuses et ont l'aspect plus vert (tabl. 25).
1-3) Influence de la composition des milieux de culture
1-3-1)
Comparaison
de
4
milieux
minéraux
Quatre milieux de base ont été comparés ; ces différents milieux ont chacun leurs
particularités :
1) le milieu de Murashige et Skoog constitue le milieu de base couramment utilisé; il
est trés riche en ions NH4+, N03- et K+ ; il est considéré comme sub-optimal en raison de
sa teneur élevée en éléments minéraux.
2) Le milieu Quoirin-Lepoivre est un milieu différent de
celui de M-S puisqu'il
contient 10 à 15 fois plus d'ions K+ P04- et Mg2+ ; les éléments azotés sont trés réduits en
particulier les ions NH4 +.
3) Le milieu de Nitsch et Nitsch contient beaucoup d'azote sous forme NH4+ et N03-;
il peut être considéré globalement comme un milieu MS dilué de moitié.
4) Le mileu Gamborg est globalement plus pauvre en éléments minéraux que les
autres. Il contient comme principale source d'azote du nitrate de potassium; les ions NH4+ y
sont en trés faible quantité.
Les explants ont subi un repiquage sur les mêmes milieux de culture au bout de 21 jours et
34 jours. A 47 jours l'expérience a été arrêtée .Les resultats obtenus sont les suivants:
A) Débourrement du bourgeon axillaire
Les méristémes pré-existants sur les explants (pl. N°11 fig A) mis en culture sur les
differents milieux minéraux s'organisent en bourgeons (pl. N°11 fig B)(tabl. 26).
* sur milieu M-S
La composition minérale du mileu M-S favorise la réactivation des méristémes axillaires ;
en effet la totalité des explants mis en culture développent une réaction morphogéne dont

96
65,2% forment des bourgeons qui évoluent en pousses feuillées. Une importante proportion
d'explants débourrent mais ne produisent que des feuilles.
* sur milieu N-N
Le nombre d'explants débourrés et caulogénes (58%) bien que important est moins élevé
que celui observé sur milieu M-S ; par contre, seul 6% des explants primaires débourrent
et ne produisent que des feuilles; par ailleurs, on observe un important nombre d'explants
sans aucune réaction morphogéne (35,5%).
* sur milieu GM
Les explants capables de developper une pousse feuillée constituent 41 % alors que les
explants produisant un bourgeon axillaire qui évolue en pousses feuillées constituent 58%
du total des explants mis en culture.
* sur milieu Q-L
Les explants mis en culture sur ce milieu produisent en grande majorité des feuilles (55%)
. Seuls 33% des explants développent un bourgeon qui s'allonge en pousse feuillée. 11 % des
explants ne présentent aucune réaction morphogéne.
B) Elongation et morphologie des pousses feuillées
Les bourgeons débourrés se développent en pousses feuillées qui s'allongent et élaborent de
nouvelles feuilles (pl. N°11 fig C) (tabl. N° 27 et 28).
* sur milieux M-S et NN
Les milieux favorisant l'élongation sont les milieux MS et NN (10,6 mm et 9 mm
respectivement ) au bout de 47 jours de culture ; d'autre part les milieux MS et NN
favorisent le développement des pinnules qui sont trés grandes et bien vertes et bien étalées.
Leur développement ultérieur est tout à fait satisfaisant. L'effet favorable de ces milieux se
maintient tout au long des sub-cultures ; le jaunisement suivi
de la
chute des feuilles
affecte un faible nombre d'explants.
* sur milieu Q-L
Au bout de 47 jours de culture, les tigelles atteignent une longueur de 7 mm et le
nombre moyen de pinnules est de 2;
les foliolules sont petites, jaunes et chlorosées ; la
chute précoce des feuilles survient à partir de la 4ème semaine et affecte 37 % des
explantats .
* sur milieu GM

97
La croissance des tigelles est plus lente par rapport aux autres milieux; les foliolules sont
vertes, petites de taille et peu ouvertes. A partir de la 4ème semaine de culture, elles
commencent à jaunir et à chuter.
1-3-2) Influence de la dilution du milieu de base M-S
La dilution des macro-éléments et des micro-éléments constitutifs du milieu de base M-S a
pour conséquence la réduction du pourcentage de caulogénèse qui passe de 77,7% pour un
milieu M-S complet à 57% pour M-S dilué de moitié et 0,5% pour M-S dilué 10 fois. Le
nombre d'explants non réactifs augmente de 18% pour le milieu M-S complet à 83,5% pour
le milieu M-S dilué 10 fois
(tabl. N° 29).
Lorsque la teneur en éléments minéraux diminue, le bourgeon réagit difficilement à
la stimulation caulogéne ; la tendance des explants à produire des cals est plus exacerbée que
dans le cas d'un milieu normal.
1-3-3) Influence de la source d'azote
De nombreux milieux de culture sont utilisés en culture "in vitro" et la plupart
d'entre eux sont trés riches en azote. Actuellement, on reconnait généralement que la qualité
aussi bien que la quantité de la source azotée joue un grand rôle dans la croissance et la
capacité à regénérer (Gamborg et al.,1 968); cependant on dispose trés peu d'informations
concernant l'estimation des besoins réels des ligneux en substances azotées (Minocha et aL,
1981).
Dans le sol, l'azote se trouve sous différentes formes:
- minérale ( N03 -,NH4+ , NO- NOZ-)
- organique en liaison avec des chaines carbonées.
Sur sols cultivés, il est fréquent de trouver l'azote sous sa forme la plus oxydée (N03-)
alors que dans les systèmes forestiers l'azote se trouve à une_ forte proportion sous une
forme réduite ( Robson, 1983). Chez les ligneux, il est probable qu'en fonction des espèces,
il existe des voies métaboliques privilégiant soit les nitrates, soit l'ammonium.
A. albida étant une espèce agroforestière par excellence, il nous est apparu intéressant
d'essayer de connaitre ses exigences nutritionnelles en azote en
déterminant la forme
(nitrate, ammonium ou organique) sous laquelle l'azote est préferentiellement puisé chez A.
albida.
D'autre part, l'existence d'une
corrélation entre la teneur en ions azotés des différents
milieux de culture précédemment utilisés et les performances morphogénétiques "in vitro"
nous a poussé à étendre le champ de l'expérimentation en étudiant l'influence des differentes
teneurs en azote sur le developpement et la croissance en tubes de vitroplants d'A. albida agés
de deux ans.

Tabl 30: Influence de la nature de la source azotée sur la croissance et le développement de vitroplants d'A.
albida pendant 30 et 45 jours
30 jours de culture
Milieux
Nbre
Hauteur (cm)
nbre feuilles
Nbre racines
Long racines
expiant
MS 0
12
3
2,33
1,66
1,33
NH41 mM
12
2,55
2,33
1,8
NH4 5 mM
12
3,3
6,5
7,3
4,1
NH4 20 mM
12
2,82
3
3
4,1
N031 mM
12
2,83
2,6
3
2,5
N03 5 mM
20
4,19
2,2
1,84
3,42
N03 20 mM
16
2,11
1,5
4,6
1,37
N03/NH4 : 1/20
12
1,7
0,8
1
N03/NH4 : 5/20
12
2,48
1
0
2,5
ASP 100
13
2,96
1,16
1,5
3
ASP 500
12
3,4
1,33
1
Glut 100
12
2,34
3
3,5
3,5
Glut 500
12
3,45
4,4
2,5
1,5
45 jours de culture
Milieux
Hauteur
nbre feuilles
Nbre
taux de
Aspect morphol à 45 jours de culture
(cm)
racines
survie
MS 0
3,46
2,4
2
80%
nécrose apex feuilles jaunes
NH41 mM
2,16
1,33
0
66,60%
feuilles vertes et vert-jaunatres
NH4 5 mM
3,91
2,5
100%
feuilles tres vertes et tres grandes
NH4 20 mM
3,3
2,5
4,5
33,30%
necrose apex couleur vert-jaunatre
N031 mM
3,5
0,16
3
100%
feuilles vert-jaunatre
N03 5 mM
3,6
0,86
2,5
64,00%
feuilles· tres vertes
N03 20 mM
1,78
0,16
5,3
37,5
feuilles vert-jaunatre
N03/NH4
0
0
0
0
nécrose totale
1120
N03/NH4
0
0
0
0
nécrose totale
5/20
ASP 100
2
42,85%
exp désseché
ASP 500
3,6
1,75
2,16
66,60%
nécrose apex
Glut 100
2,16
3
3,6
83,30%
feuilles vertes début de necrose apex
Glut 500
3,75
3,5
3,5
100%
feuilles vert-jaunatre

98
1-3-3-1) Nutrition azotée et morphogénèse "in vitro"
A) azote minéral
A-l) hauteur totale
Le taux de croissance le plus élevé est obtenu en présence d'ions N03- (5mM); les ions
NH4+
à 5 mM favorisent aussi une bonne croissance des tigelles bien qu'elle soit moins
importante que dans le cas où les ions N03- sont utilisés (fig N° 8 et 9). L'effet bénéfique
des ions N03- sur la croissance se manifeste tres tôt dés le 15ème jour de culture, alors
qu'en présence d'ions NH4+, ce n'est qu'au bout de 30 jours de culture que les explants
s'allongent rééllement. Les ions NH4+ à 20mM permettent une croissance satisfaisante des
tigelles.
Sur les autres milieux la croissance est quasi stationnaire et au bout de 45 jours, on peut
même noter une décroissance liée à la nécrose des apex suivie de la mort de l'expiant entier.
Lorsqu'on combine l'azote sous forme ammoniacal à l'azote sous forme nitratée, leur addition
simultanée entraîne une baisse de la croissance.
A-2) biomasse foliaire
En considérant la biomasse foliaire produite, on constate que le milieu contenant 5 mM
d'ions NH4+ (fig 9) favorise la production d'une biomasse foliaire importante. Cette
biomasse chute 10 jours aprés la transplantation ; 30 jours plus tard, il s'ensuit une
augmentation de la biomasse; aprés 45 jours de culture sur le même milieu, la plupart des
explants ont perdu leurs feuilles (fig. 10-11). Les feuilles formées chutent sans être
remplacées par de nouvelles.
Les autres milieux donnent des résultats sensiblement identiques ; en outre en présence
d'une combinaison NH4/N03- (1 /20 et 5/20 mM) les performances sont les plus faibles;
les explants aprés une phase stationnaire de croissance au bout de 3 semaines, se nécrosent
et dégénèrent rapidement.
A-3) enracinement
L'optimum concernant l'induction et la formation de racines adventives, est obtenu en
présence de NH4 5 mM (fig N° 12 et13) où 7 à 10 racines adventives sont formées par
expiant au bout de 30 jours de culture. Le milieu N03- 20mM (fig 12)favorise aussi une
bonne rhizogénèse de même que le milieu NH4 20 mM . Les racines formées s'allongent bien
dans le milieu de culture. Les mêmes contre-performances obsrevées en d'une combinaison
NH4/N03 en matiière de croissance et de production de biomasse, se retrouvent lorsqu'il
s'agi d'enracinement des tigelles sur ce milieu.
B) Azote organique
8-1) Hauteur totale

() N 0
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ONH45
NH420
-5
- 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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99
L'addition d'asparagine et de Glutamine à 3,5 mM permet de maintenir un taux de croissance
satisfaisant pour les explants (fig N° 14). Lorsque la teneur en ces deux éléments azotés est
ramenée à 0,7 mM la croissance est ralentie.
B-2) Biomasse foliaire
A 45 jours de culture, la présence de gutamine (0,7 à 3,5 mM) permet de maintenir et
d'améliorer le nombre de feuilles produites par tigelle (fig N° 15); lorsque c'est
l'asparagine qui est la seule source azotée, on assiste à une chute précoce des feuilles, chute
qui n'est pas suivie d'un renouvellement foliaire.
B-3) enracinement
L'optimum du nombre moyen de racines par tigelle est obtenu en présence de la glutamine
(0,7 et -3,5 mM) (fig N° 16)
1-3-3-2) Taux de survie des tigelles à 45 jours
Sur un milieu dépourvu d'azote, on note une nécrose fréquente des apex. L'aspect
général des plantules dénote une mauvaise croissance et la couleur des feuilles est
caractéristique d'une déficience azotée marquée. Malgré tout ces plantules se maintiennent
durant toute la culture avec un taux de survie de 80% (tabl. N° 30).
En présence d'azote minéral disponible soit sous forme N03- soit NH4+, les explants
sont généralement chlorophylliens jusqu'à la 4ème semaine; au delà, seuls ceux qui sont
cultivés sur un milieu NH4+ 5 mM et N03- 5mM conservent une morphologie satisfaisante
absence de nécrose de l'apex, feuilles chiorphylliennnes, tige en croissnace et nombreuses
racines adventives). Les autres explants montrent des signes de nécrose de l'apex et les
feuilles présentent une couleur vert-jaunâtre. Le taux de survie le plus élevé (100%) est
obtenu en présence de NH4+ 5mM.
La combinaison NH4+ IN03- n'est pas du tout favorable à un bon développement des
explants qui commencent à dépérir dés la 3ème semaine. Apres 45 jours de culture, la quasi
totalité des explants ont dégénéré par suite d'une nécrose totale des tissus.
Les explants cultivés sur milieu contenant de la glutamine commencent à se nécroser et à
jaunir à partir de la 4ème semaine; cependant leur aspect général n'est pas critique. Par
contre en présence d'asparagine les explants sont en majorité nécrosés ou dessechés.
1-3-3-3) Matière séche
Les tigelles sorties du tube
ont été séchées à l'étuve pendant 15 jours; l'évaluation
du poids sec moyen des vitroplants par traitement azoté, nous permet d'apprécier la
biomasse moyenne produite pour chaque traitement.

Fig NV 18 : Cornp.'lnisofl d€' 4 milio?lJ>::~zcotés (l'..dditi('f1 .:l'azcoto? ·rlU milio?lJ M-S de b.a:::€' 5t? f.rla sou::: formt' org.aniqut') t't un
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....."
L

100
En considérant la biomasse sèche produite (fig N° 19), on constate que les meilleures
conditions de croissance et de développement sont réalisées en présence d'une source d'azote
équivalente ou proche de 5 mM Il que la source azotée soit minérale ou organique; en effet la
glutamine (500 mg/l) constitue une source azotée qui peut remplacer les nitrates car la
biomasse produite dans les deux cas est sensiblement la même. Les explants cultivés sur un
milieu dépourvu d'azote malgré leur aspect chlorotique produisent une biomasse supérieure
à celle obtenue en présence d'une combinaison NH4+1 N03- (5/20 mM) ou bien en présence
d'asparagine, où aprés une phase stationnaire de croissance, on observe une dégénérescence
totale.
l:.ilEtude de facteurs susceptibles de prévenir l'abscission foliaire
Nous avons remarqué chez A. albida que les pousses développées à partir de bourgeon
axillaire "in vitro" ont tendance à perdre leurs feuilles prématurément au delà de 4
semaines de culture . Le jaunissement suivi de la chute des feuilles, débute à la base de la
tigelle puis gagne la totalité de la tige (pl. N°12 fig A). La croissance est alors ralentie et la
tigelle végéte. Pour prévenir cette chute des feuilles, nous avons cherché à améliorer les
conditions de culture par transfert des explants sur milieux neufs ou par addition de
substances testées sur d'autres espèces en vue d'enrayer l'abcission foliaire.
1-4-1) Fréquence des transferts sur milieux neufs
Les explants ont été régulièrement transférés sur milieux nutritifs neufs dans le but
d'améliorer leur taux de survie.
Nous avons comparé des explants repiqués régulièrement à des explants cultivés dans les
mêmes conditions mais sans repiquage pendant 28 jours (tabl. N° 31).
Le repiquage fréquent améliore notablement la réponse morphogénétique
et la
croissance des vitroplants ; en effet le repiquage sur un milieu neuf au bout de 20 jours de
culture permet aux explants qui n'avaient pas réagi en début de culture
de trouver les
conditions adéquates à une bonne expression de la morphogénèse; le pourcentage de
caulogénèse augmente aussi avec le repiquage.
L'elongation est particulièrement favorisée; le taux de croisance est de 259 % par rapport
au témoin qui n'a pas été repiqué. Le rafraîchissement fréquent de la base de l'expiant, le
renouvellement fréquent des éléments nutritifs de base agissent sur l'allongement et
prévient la chute des feuilles puisque les explants conservent leurs feuilles pendant GO
jours au bout desquels on commence seulement à observer une chute des feuilles.

Tabl N°31 : Influence des transferts successifs aprés 15, 19,25,35,48,60 jours sur un milieu M-S neuf sur 'le débourrement et la croissance des bourgeons
axillaires des nœuds d'A. albida .
1Explants non transférés
1
Explants
transférés
1
Morphogénèse
Morphogénèse
LONGUEUR
(mm)
age de la culture
axes de tige Nbre
LONGUEUR
transferts à n
bourgeon débourré
axes de tige
~
(nm)
jours de culture
Nbre
%
Nbre
%
7 j
36/54
66
3/54
5
0 1
12 j
10/48
20,8
2,45 ± 1,5
15 j
45/54
83
12/54
22
5,36 ±4,05
16 j
14/48
30
4,38 ± 3,1
19 j
46/54
86
17/53
32
7
±
6,06
20 j
14/48
30
5,03
± 4
25 j
49/54
90
18/53
33
8,21 ±6,42
28 j '*
14/48
30
5,83 ± 5,6
35 j
49/54
90
18/53
33
11,14 ±9,18
35 j
14/48
30
6,5 ± 5,8
48 j
49/54
90
18/53
33
13,92 ±9,9
60 j'*
49/54
90
18/53
33
15 ±10,32
Les jours marqués d'un astérisque ('*) représentent la date à partir de laquelle les explants commencent à perdre leurs feuilles

101
1-4-2)
Addition
de
substances
suceptibles
de
prévenir
la
chute
prématurée
des
feuilles
En présence de phloroglucinol utilisé à des concentrations élevées (500 à 1000
mg/L) le délai de reprise de l'activité du méristème caulinaire est réduit à 3 jours. Le
nombre de bourgeons débourrés est plus important (95,8%) (tabl. N°32) ; la caulogénèse
est favorisée (33,3%), ces bourgeons s'organisent en pousses feuillées trés allongées.
L'addition de phloroglucinol à 1000 mg /L a pour conséquence une nette stimulation de
l'élongation des pousses formées qui attejgnent 7 à 8 cm au bout de 2 mois de culture sans
repiquage.
Ces tigelles sont particulièrement distinctes des tigelles obtenues pour les autres
traite":!ents effectuées sur les explants adultes d'A. albida par leur extrême vigueur et le
développement des feuilles trés chlorophylliennes bien étalées et trés grandes (pl. N° 12 fig
B). Sur ces milieux le taux de survie foliaire déterminé par le nombre d'explants qui
conservent leurs feuilles intactes, est le plus élevé ; en effet, les explants conservent leurs
feuilles pendant 60 jours au bout desquels on commence seulement à observer une chute des
feuilles (tabl. N° 33).
L'addition de la glutamine et de l'adénine permet le débourrement des bourgeons axillaires;
des ébauches se forment mais restent bloquées à ce stade. La glutamine n'améliore pas le taux
de survie; la plupart des explants présente une croissance extrêmement lente; la chute des
feuilles survient au bout de 28 jours.
L'addition de l'adénine a un effet inhibiteur sur la formation des pousses et stimule la
formation de cal à la base de l'expiant; la défoliation apparait de façon précoce par rapport
aux témoins.
1 - 5)
Multiplication du
bourgeonnement
axillaire
De faibles concentrations en cytokinine BAP ( 0,5 mg/I) associées à l'ANA (1 mg/I)
ne pouvant pas induire la multiplication du bourgeon axillaire, nous avons été amenés à
définir une méthode favorisant la stimulation et la formation de nombreux bourgeons
axillaires à partir d'un seul noeud.
L'imprégnation des noeuds d'A. albida dans une solution de BAP à 20 mg/I pendant 15
heures, a pour effet de stimuler la caulogénèse lorsque par la suite, les nœuds sont cultivés
sur un milieu M-S dépourvu de cytokinine et ne contenant que de l'auxine; en effet en
l'absence de stimulation un seul bourgeon axillaire se développe (PI. N° 13 fig A). A la suite
de l'imprégnation par la BAP des méristèmes axillaires, l'organogénèse est activée et elle se
manifeste par la sortie de plusieurs bourgeons axillaires (PI. N°13 fig B). Les méristèmes

Tableau N° 32: Influence de l'addition de substances organiques (adénine, glutamine, phlotoglucinol) au
milieu M-S de base sur l'expression morphogénétique d'explants d'A. albida cultivés pendant 68 jours
SUBSTANCES Concentrat.
débourement
Caulogénèse
Elongation
remarques
bourg. axill.
(mm)
(mg/I) Nbre
%
Nbre
%
aprés 45 j
formation de
1000
46/48
95,8
16/48
33.3
29,06
pousses vigoureuses
Phloroglucinol
500
17/24
70.8
8124
33.3
27
feuilles bien étalées
250
16124
66.6
7/24'
29,1
14,33
bon allongement
100
5124
20,8
5/24
20
2
1000
24/24
100
0
débourrement du
glutamine
500
24/24
100
0
bourgeon axillaire
250
14/24
50,33
0
pas de pousses for-
mées mais formation
100
14124
50,33
0
feuilles uniquement
1000
2112
16,66
0
débourrement du
Adenine
500
3/12
25
0
bourgeon axillaire
250
6/12
50
0
formation de feuilles
100
4/12
33
0
pas de caulogénèse mais
importante callogénèse
temoins
MS + CA
10124
41
3/10
30
7,8 ± 6,4
débourrement et
chute prématurée
des feuilles
Tableau N° 33 :Influence de l'addition de substances organiques (adénine, glutamine et phloroglucinol)
au milieu de base (M-S) sur la chute des feuilles d'explants d'A. albida cultivés pendant 68 jours
SUBSTANCES
Concentrat.
délai
reprise
durée de la
Explants feuillés
mg/I
méristem U>
feuillaison
Nbre
%
1000
3
60
27/48
56,2
500
15
43
6/24
25
Phloroglucinol
400
15
55
5124
20,8
250
15
33
2124
8
100
15
24
0124
0
1000
20
5/22
22,7
glutamine
500
12
28
6124
25
250
12
28
4/24
16,6
100
12
28
2124
8,3
1000
5
Adenine
500
4
28
6/24
25
250
5
22
6124
25
100
5
22
8124
33
temoins
MS + CA
11
30
6/24
25

102
caulinaires qui en principe, ne produisent qu'un seul bourgeon axillaire sont stimulés pour
en former plusieurs. Cette activation concerne la totalité des explants mis en culture (tabl.
34).
L'action stimulante dè la BAP
se manifeste au bout d'une durée de culture
relativement longue de 28 jours sur un milieu dépourvu de cytokinine et ne contenant
qu'une auxine l'ANA.
Les explants ont été suivis à 28 jours, 38, 42 et enfin 53 jours aprés leur transfert sur un
milieu dépourvu de BAP.
28 jours aprés la mise en culture des nœuds, la fréquence relative du nombre de bourgeons
par expiant montre que 50% des explants ont formé 1 bourgeon, 30% en ont formé 2, 11 %
en ont formé 3 et 9% ont formé 4 bourgeons visibles (fig 20).
.38 jours aprés la date de la mise en culture, la fréquence relative du nombre de
bourgeons est différente; en effet le nombre d'explants présentant 3 à 4 bourgeons est accrû
de 20 à 30%, le nombre d'explants avec 2 bourgeons augmente de 20 à 30% alors que le
nombre d'explants avec 1 bourgeon diminue de 50 à 20%.
C'est à partir de 53 jours de culture qu'on peut observer des explants ayant développé 5
bourgeons axillaires.
D'autre part, nous avons constaté une forte dominance d'un des bourgeons formés sur
les autres qui se développe beaucoup plus rapidement que les autres. C'est au bout de 42
jours de culture que nous avons séparé les bourgeons dominants des autres pour les repiquer
séparément sur un milieu neuf.
A la suite de l'ablation du bourgeon dominant, on constate un débourrement des autres
bourgeons qui évoluent en pousses.
Cependant il faudra faire remarquer que l'aspect des pousses dans ces cas est different ; en
effet suite à une élongation trés rapide des entre-nœuds (tabl. N° 35), les primordia
foliaires ne se développent pas et les pousses obtenues ne possèdent que des ébauches
foliaires.
1- 6 LEnracinement des
tigelles
1- 6-1) Influence du milieu de base
Lorsque les nœuds sont placés sur 4 milieux de base (Q-L; M-5; NN ; GM) à la suite
de deux repiquages successifs, et aprés une observation à 47 jours, un certain nombre
d'entre eux s'enracinent spontanément sans un traitement préalable à l'auxine.
Le taux
d'enracinement est variable en fonction des éléments de base contenus dans le milieu.
JI est
apparu que les milieux les plus pauvres en éléments minéraux (N-N et GM) sont ceux qui
favorisent la plus grande réactivité vis à vis de l'enracinement (tabl. N° 36); en effet le
taux optimal dans ces conditions est obtenu avec le milieu GM (25,8%) et le milieu NN

Tabl N° 34: Action d'une forte stimulation à la BAP (20 mg/l pendant 15 heures) suivie d'une culture sur
milieu M-S dépourvu de cytokinine et additionné d'AIA (0,5 mg/l) sur l'activité caulogène et la fréquence
d'apparition des bourgeons d'explants d'A. albida .Les observations ont été faites à 28 jours, 38 jours, 42
jours et 53 jours de culture.
durée
Nombre
Explants avec
Explants avec
Explants avec
Explants avec
Explants. avec
d'exp!.
1 bourgeon
2 bourgeons
, 3 bourgeons
4 bourgeons
5 bourgeons
Nbre
%
Nbre
%
Nbre
%
Nbre
%
Nbre
%
28 jours
48
24
50
14
29,2
6
12,5
3
6,2
0
0
38 jours
48
10
20,8
24
50
8
17
6
12,5
0
0
42 jours
41
9
22
20
48,7
7
17
5
12
0
0
53 jours
39
0
0
15
38,5
12
31
7
18
5
13
Tabl. N°35:
Action d'une forte stimulation à la BAP (20 mg/l pendant 15 heures) suivie d'une culture
sur milieu M-S dépourvu de cytokinine et additionné d'AJA (0,5 mg/l) sur l'élongation des bourgeons issus
d'explants d'A. albida . Les observations ont été faites à 38 jours et 42 jours de culture.
1
Traitements durée de culture
longueur (mm)
nbre entre-nœud
Exp!ants activés
38 j
14,3 a
par la BAP
42 j
18,3 a
7,3 a
Explants témoins
30 j
10,6 b
4,1 b

Fll?" N" (;I): IllI11J.i::ru;~ .lI? l'imprè~l.tioIL 11~s D.'B'!I!:; 11' A. ilJ.Oh. d3JJS 1!Jl.~ sol1J.tl.t)D. ,~BAP f20 ID.:?,'11 t'~:rub.I11 15 h~lJ.t1!n $1!f l'int~ll5i!.~ I~ ~.
·~~",.ù1)~~!l.Ü~ "ÎIl. vitro" . Le:; üketw.tioIL$ O)J1t ~t~ faites ~ 28 j('I.It"S.• 38 j.)IJ.YS, 42 jOlJn -:t 53 jOl\\t"$ de ';1.ùt'IJJe"
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a
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...
x
:-:
~
'"

Tabl N°36 : Influence de la composition minérale du milieu de culture sur l'enracinement de tigelles d'A.
albida aprés 47 jours de culture
Milieux
nbre explants
plants enracinés
presence de cals
Nbre
%
Nbre
%
M-S
23
3/23
13
7/23
30
t-t.I
31
7/31
22,5
0/31
0
GM
31
8/31
25,8
6/31
19,3
Q-L
27
3127
11,1
5/27
18,5
Tabl N°~7 : Influence de 3 auxines sur l'aptitude à la rhizogenese "in vitro" de tigelles d'A. albida
aprés 35 jours de culture sur milieu M-S de base
Auxine
conc
apparit° 1ères
Taux
présence de cal
morphologie
(mg/l)
racines
d'enracinement
racinaire
nbre
%
nbre
%
ANA
1
0
0
ANA
5
11 jours
6/24
25
2/6
33,3
longues fines
AIB
1
0
0
AIB
5
11 jours
6/24
25
3/6
50
épaisses courtes
AIA
1
28jours
6124
25
1/6
16,6
longues fines
Tabl N° 38: Influence de la pré-culture des tigelles d'A. albida en présence de M-S additionné de
Phloroglucinol (lg/l) sur l'enracinement; les résultats sont obtenus aprés 35 jours de culture
1milieu
concentration
Nbre tigelles
taux enracinement
Apparition racines 1
tigelles ayant subi
le traitement
au Phloroglucinol
(1 g/l)
MS + AIB
5 mg/l
12
59,60%
11 jours
1 mg/l
14
33,30%
30 jours
WPM + AIB
5 mgIl
9
30,70%
17 jours
1 mg/I
10
37,50%
16 jours
tigelles témoins n'ayant pas subi de traitement au phloroglucinol
MS + AIB
5 mg/I
12
25%
13 jours
1 mg/I
10
0%

103
(22,5%). la culture sur M-S pendant 47 jours favorise la formation d'un cal basal alors
sur milieu NN aucun cal n'est formé.
1- 6 - 2) Influence de la nature et de la concentration en auxine
3 auxines ont été testées: l'ANA, l'AIA , l'AIB à des concentrations variant de 1 à 5 mg
II. Le matériel végétal est constitué de vitroplants préalablement cultivés pendant 1 mois
et demi sur milieu M-S jusqu'à atteindre une hauteur de 3 cm en moyenne. Ces vitroplants
proviennent de culture à partir de noœuds prélevés sur les drageons cultivés. Le milieu
d'enracinement utilisé est le milieu M-S.
Les plants réagissent trés rapidement (11 jours) à des concentrations élevées (5 mg
Il) d'ANA et d'AIB (tabl. N°37). Par contre pour l'AIA la réponse est plus longue mais sans
callogérièse avec des racines fines et longues qui se développent bien dans le milieu de culture
(PI. N°14 fig C). L'optimum d'enracinement obtenu est de 25% pour les 3 auxines utilisées;
les différences se situent au niveau de la concentration et de la morphologie des racines; en
effet si pour l'ANA et l'AIB, 5mg/l sont nécessaires pour déclencher la rhizogénèse "in vitro"
par contre en utilisant l'AIA comme hormone d'induction, on s'aperçoit qu'une plus faible
dose suffit pour la production des racines. Par ailleurs, l'AIB produit des racines longues et
bien développées (PI. N°14 fig A) alors qu'en présence de l'ANA, on note souvent la présence
d'un cal basal (PI. N° 14 fig B).
1 -6-3) Influence
d'une
pré-culture
au
phloroglucinol
L'addition d'une substance de nature phénolique telle que le phloroglucinol est susceptible
d'induire des modifications au niveau du végétal pouvant affecter ou stimuler la réponse à la
rhizogénèse.
Des pousses préalablement cultivées sur un milieu contenant du phloroglucinol
(1 g/l) et suffisamment allongées, ont été prélevées aprés séparation de l'expIant primaire
puis mises à enraciner sur 2 milieux de culture MS et WPM additionnés d' AIB à1 et 5 mg/!.
Des tigelles ayant été cultivées sur M-S sans phloroglucinol sont utilisées comme témoins.
Les explants
préalablement cultivés sur phloroglucinol s'enracinent au bout d'une durée
variable de 11 à 30 jours (tabl. N° 38); alors que chez le témoin seuls 25% des tigelles
s'enracinent exclusivement sur milieu AIB 5 mgll. 1/ appararait ainsi que la pré-culture
sur milieu additionné de Phloroglucinol améliore l'enracinement des plants d'Acacia albida
L'optimum d'enracinement est obtenu (59,6%) avec la combinaison M-S + AIB 5mg/l avec
un délai minimal d'apparition des premières racines de 11 jours. L'evolution des tigelles
déterminée par le nombre de racines formées et leur longueur (fig N° 21), montre
une
nette stimulation de la rhizogénèse "in vitro" en présence de phloroglucinol.

Fiq. N" 2t: Ewlu.twll. PèIuÙJlt 35 jO'\\l1$ d2 là t·1i:Ogé~$è d.e$ di! tigèllis .r A_ JMi.& :pt~ili.1~m.èfJ.t
clüthrées en présen.ee de PhloroghtcÎllOl (1~1) p~n.da1Lt 1)0 jOl.1J"S nIT miliel.\\ MS + AIB 5m~L
25 1
1
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1
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1
J
0 - - - - -
5 l...--""Tl-----~Ir-----~l------r------,.I---
~
~
~
~
~

lOS
1- 7) Conclusions
et
discussions
La micropropagation "in vitro" d'arbres adultes ayant exprimé leurs potentialités est la voie
la plus rapide et la plus efficace pour améliorer les peuplements forestiers. Cependant,
comme cela a été montré chez de nombreuses espèces d'arbres, la plupart des ligneux en
particulier les arbres sahéliens sont trés récalcitrants à la multiplication végétative (Mc
Cown et Mc Cown, 1987; Badji et al.,1992). La propagation par voie végétative d'Acacia
albida à partir d'arbres adultes pose de nombreux problémes. Ces difficultés sont
liées
principalement à l'obtention d'une culture saine à croissance optimale et à développement
continu. Plusieurs facteurs interviennent .
A) La saison
Le degré d'expression morphogénétique est soumis à l'influence de la saison chez Aalbida ; en
effet la période la plus propice à la réactivation des bourgeons axillaires, est la périC?de
allant du mois de Novembre au mois de Mai ; cette période coincide avec la période de
croissance active végétative et à la floraison. Cette période, consécutive à la phase de repos
durant l'hivernage est caractérisée par le débourrement des bourgeons, l'allongement des
pousses feuillées nouvellement formées et la floraison. Cette phase est surtout caractérisée
par une remobilisation et une circulation des assimilats en particulier les sucres
(Bory,1992); chez Antiaris africana (Olofonboba, 1969) l'évolution des teneurs en sucres
du bois est lié à la phénologie de la plante; en effet à la suite de la phase de repos et avant la
phase de croisance active, on remarque souvent une augmentation transitoire de l'amidon une
mobilisation et une migration des réserves glucidiques lors du gonflement des bourgeons
(Bory, 1992). De même, c'est au cours de cette phase que les organes floraux s'édifient et
où, lors de la méiose précédant la formation des gamètes, on assiste à un rajeunissement
global des méristèmes
(Holliday et Pugh, 1975 ; Demarly et Sibi, 1989; Bonga, 1982 ).
Ce rajeunissement se traduit par la néoformation "in vitro" de pousses enracinées et
d'embryons à partir de lignées cellulaires somatiques proches des sites où se déroule la
méiose; ce phénomène a été observé sur des fragments de pédoncules inflorescentiels chez le
palmier à huile ( Reynolds, 1981) ou de pédoncules de cones femelles immatures chez Pinus
mugo (Bonga, 1982).
L'augmentation nette du taux de morphogénèse au cours des mois de Février et Mars serait
donc
liée
à cette période favorable où tous les méristèmes
se trouvent
dans un
environnement nutritionnel et hormonal optimal.
B)
L'origine du matériel végétal
Il a souvent été démontré que les potentialités morphogénétiques des tissus matures sont
tributaires de l'origine du matériel végétal (Boulay, 1979; Franclet, 1980). L'utilisation
des techniques de multiplication végétative horticoles ou "in vitro" chez les arbres

106
forestiers matures, nécessite la localisation ou l'induction préalables "in situ" sur l'arbre
des zones ayant conservé leur état juvénile (Franc/et, 1979).
Nous avons montré que les drageons prélevés à proximité du système racina ire ont révélé des
potentialités morphogénétiques nettement plus importantes que les rejets ou les pousses
prélevées sur la cime même pendant la floraison.
Les drageons de Faidherbia albida syn. Acacia albida
(Danthu,1 992 ), et d'Acacia koa
(Skolmen et Mapes,1 976), développés à partir du système racinaire, ont montré un niveau
de juvenilité se manifestant par un taux de morphogénèse plus élevé que celui des rejets ou
des ramets récoltés sur la cime ainsi qu'une morphologie de type juvénile.
Nos résultats en culture "in vitro" confirment ainsi que la proximité des explants initiaux
avec le système racinaire de la plante est un facteur déterminant dans l'expression de la
caulogénèse "in vitro"; le corrolaire à cette proximité racinaire est une meilleure
alimentation en eau, en éléments minéraux et en sucres (car les racines d'A. albida
contiennent d'importantes reserves amylacées ).
C) Réduction· de l'oxydation de polyphénols par le pré-trempage
Certaines substances telles que les polyphénols sont accumulées au sein des tissus et peuvent
être inhibitrices de la croissance et de l'organogénèse. Il est possible que dans les tissus
adultes même rajeunis partiellement, subsistent ces substances inhibitrices de la croissance
de type polyphénols.
Le pré-trempage permet l'exsudation de substances inhibitrices de l'expiant et favorise sa
croissance ultérieure (Cresswell et Nitsch, 1975).
Comme l'a précédemment montré Songa, (1977) en utilisant des bourgeons dormants
d'arbres âgés de 15 à 20 ans d'Abies balsamea, le pré-trempage soit dans de l'eau distillée ou
dans une solution d'acide cafféique, améliore l'organogénèse "in vitro". Nous avons montré
que par rapport aux solutions salines de M-S/2, la solution contenant les ions NH4 + ou la
solution aqueuse favorise la survie des tigelles pendant au moins 3 jours. La culture
subséquente améliore le taux de morphogénèse "in vitro" .
D) la fréquence des repiquages
L'organogénèse "in vitro" d'explants adultes dépend de la miniaturisation de l'expiant qui,
libéré des corrélations inhibitrices "in situ", exprime ses potentialités morphogénétiques
(Franc/et, 1981). Nous avons montré chez A. albida qu'un repiquage fréquent a un effet
favorable sur le développement des bourgeons en pousses feuillées. Cet effet positif est lié
d'une part à la réitération de la blessure à la base de l'expiant, au moment du transfert
tendant à activer les méristèmes quiescents, et d'autre part, à la disponibilité d'éléments
nutritifs aprés chaque transfert sur un milieu neuf. Ces résultats s'accordent avec ceux
obtenus par
Nozeran (1978); de la Goublaye (1980); Franclet, (1981); Moncousin

107
(1982); Detrez et aL, (1992) qui ont montré que les repiquages successifs ou les micro-
greffages réitérés d'apex améliorent de manière significative la croissance et le
développement des tigelles.
E) Les milieux minéraux de base
Au cours de nos experiences, il nous a été permis de définir les conditions satisfaisantes pour
la regénération "in vitro" chez Acacia albida.. La comparaison de quatre milieux minéraux
sur la base de leurs performnaces morphogénétiques, a révélé que le milieu de Murashige-
Skoog est l'un des meilleurs milieux utilisé en vue de la regénération de plantes entières. En
effet ce milieu favorise la caulogénèse et la croissance en pousse feuillée vigoureuse.
. D'autre part, nous avons pu constater que les milieux MS et NN caractérisés par leur
richesse en ions NH4+ et N03- sont ceux qui favorisent le plus la croissance et le
développement des explants adultes d'Acacia albida. Il est apparu que l'élément déterminant
dans la réponse à l'organogénèse "in vitro" chez Acacia albida est l'azote. Cet azote se trouve
sous deux formes ioniques; NH4+ et N03- ; parmi ces 2 formes compte tenu du classement
respectif des differents milieux de culture en fonction de leur teneur en ces 2 ions, il est
apparu que l'ion NH4+ discrimine le mieux les différentes réponses observées.
En effet, au vu des résultats, il appparait que la concentration en ions ammonium
explique le mieux le classement obtenu entre les differents milieux de culture ; ainsi, nous
pouvons constater que les performances obtenues sur les différents milieux de culture
utilisés, décroissent avec la diminution de la teneur globale en ion NH4 +.
Il existe donc une corrélation nette entre la teneur en ions azotés et la réactivité "in vitro".
Le rôle prépondérant de la teneur en azote du milieu de culture a été démontré chez le
peuplier (Mc Cown et Selmer,1987) et le walnut
(Driver et Kunuyuki, 1984) ou le
réajustement de la teneur en NH4N03 du milieu WPM à des teneurs proches de celles du
milieu M-S améliore de façon notable la croissance.
F) Nutrition azotée minérale et organique
- Azote minéral
L'étude de la nutrition minérale azotée chez Acacia albida a montré que cette espèce ne
présente pas une grande exigence nutritionnnelle vis à vis de telle ou telle source azotée. Par
contre elle est trés sensible à la concentration ionique globale où l'optimum est atteint à 5
mM/L. En présence
de faibles teneurs azotées, ( 0.7 à 1 mM/L) la croissance est trés
réduite; à des teneurs moyennes (5 mM/L) l'optimum de croissance est obtenu; à des
teneurs élevées (20 mM/L), le developpement est réduit.
Il est apparu au cours de cette experience que l'ammonium est bien assimilé par la plante à 5
mM / L, même à 20 mM/l, il est toléré par la plante.

108
Contrairement à ce qui est généralement admis en culture "in vitro", la présence des ions
ammonium ne constitue pas un facteur inhibiteur de la croissance chez Acacia a/bida.
En outre, il a été constaté qu'un développement optimal de la biomasse foliaire ainsi que de la
biomasse racinaire est plus fréquent sur les milieux ne contenant que l'ammonium comme
source d'azote.
Les ions NH4+ se comportent comme des cations antagonistes de K+ et de Ca 2+ ou
Mg2+ (Helier, 1991); une concentration excessive en ions ammonium pourrait avoir comme
conséquence d'induire une carence en ces ions; c'est pour cette raison que la plupart des
auteurs (Margara, 1985) considèrent que les ions NH4+ sont toxiques lorsqu'ils sont
utilisés en culture "in vitro" et bien que l'addition d'ions Ca 2+ réduise la toxicité des ions
ammonium,
ils tendent souvent à abaisser sa teneur ionique globale dans le milieu de
culture. Mais inversement, la présence des ions NH4+ favorise l'entrée des ions P04-.
L'assimilation de l'azote "in vitro"
est variable et les besoins spécifiques en nitrates ou
ammonium sont differents en fonction des espèces et de l'âge des plants.
Minocha, (1981) a montré sur le bouleau que les explants agés de 10 semaines environ se
développent indifféremment sur les deux sources d'azote alors que les explants agés de 20
semaines nécessitent du nitrate pour se développer. Chez Prosopis a/ba (Tabone et aL, 1986)
la présence d'ions N03- favorise la croissance et le développement foliaire.
Daguin et aL,1991 sur des vitroplants de Mahonia japonica ont montré que les différents
cultivars testés préfèrent une source d'azote ammoniaquée par rapport à une source nitratée.
Sur le pistachier (Abousalim, 1991) et chataÎgner (Vieitiez et aL,1986) les auteurs ont
mis en exergue l'importance de la réduction des ions NH4 + sur l'optimisation de la
croissance des clones.
Les meilleures conditions d'élongation sont obtenues en présence d'ions N03 à 5mM
alors que les fortes teneurs en ions N03- (20mM) sont défavorables à la croissance et à la
morphogénèse chez A. a/bida .
Nous avons aussi démontré que la combinaison NH4/N03 (1/20 et 5/20) inhibe la
morphogénèse chez A. a/bida; l'addition simultanée de ces deux ions ne produit pas l'effet
positif additif escompté sur l'organogénèse "in vitro", les explants apres une phase
stationnaire se nécrosent et dégénèrent totalement.
On considère généralement que lorsque deux facteurs pris séparement ont chacun un effet
positif, alors que ces mêmes facteurs pris ensemble produisent un effet négatif, on doit
considérer qu'ils corrigent tous deux un même déficit (Robson, 1983). Les ions N03- et
NH4+ agissent tous deux pour répondre aux mêmes besoins spécifiques de la plante; leur
addition simultanée dans le milieu de culture n'est pas nécessaire, une seule source azotée
suffit et celle qui est nous est apparue être la mieux adaptée aux besoins de l'espèce est
l'azote sous forme ammoniacale.
Sur les sols cultivés il est fréquent de trouver l'azote sous sa forme la plus oxydée alors que
dans les systemes forestiers l'azote se trouve à un forte proportion sous une forme réduite
(Robson 1983). Par conséquent une nutrition azotée ammoniacale nous semble être un point

109
particulièrement intéressant lorsqu'on considère la place de l'A. albida dans un système
agro-forestier sahélien. Si les plantes cultivés annuelles utilisent l'azote sous une forme
oxydée, l'arbre qui leur est associé n'est pas concurrentiel dans la mesure où il prélève
préferentiellement "azote ammoniacal. En outre, par sa capacité d'élaborer des nodules
fixateurs il restitue au sol d'importantes quantités d'azote.
- Azote organique
L'utilisation de la glutamine comme source azotée permet de répondre aux besoins
nutritionnels d'A. albida . En effet la glutamine semble être plus assimilable ou plus
efficiente que l'asparagine. Ici encore la réponse organogéne de l'expiant est déterminée par
la concentration ionique; l'optimum de réponse est obtenu à 3,5 mM alors qu'à 0,7 mM la
répon~e morphogénétique est faible.
la glutamine et l'asparagine sont les premiers produits exportés à partir de la
symbiose fixatrice d'azote chez A. albida (Diouf 1995). Ces produits sont facilement
solubilisés, rapidement disponibles pour la synthèse protéique et les autres voies
métaboliques contrairement aux uréides qui ont une faible solubilité (Sprent, 1979). Ces
produits sont rencontrés à l'état libre dans la sève brute et la sève élaborée et constituent
une des formes de transport les plus fréquentes des amides. Dans les bulbes et les
tubercules, ils constituent les formes sous lesquelles l'azote est stocké (Helier, 1991).
L'azote organique s'est révélé être un important facteur pour favoriser "in vitro" le
développement de la pousse; Gamborg (1970) a montré que les seules amides glutamine et
asparagine sont susceptibles de remplacer le (NH4) 2 S04 en culture cellulaire de cals de
soja en permettant le maintien d'un taux de croissance élevé pendant une longue période.
G)
l'abscission
foliaire
des tigelles
formées "in
vitro"
Chez les arbres adultes , la maturation s'accompagne souvent de phénomènes
complexes d'adsorbtion et de rétention différentielle de substances (rapport Calcium/
Potassium; rapport N03-/NH4+;
auxine/ cytokinine protéines de maturation etc ... )
certaines substances telles que les polyphénols sont accumulées au sein des tissus; elles
peuvent être inhibitrices ou activatrices de la croissance et de l'organogénèse.
Chez A. albida, l'addition de
phloroglucinol à des concentrations élevées (1000 mg/I)
améliore la croissance des pousses et prévient la chute des feuilles pendant GO jours.
Chez Leucaena leucocephala (Dhawan et Bjhowani, 1985), J'abscission foliaire est réduite
aprés addition de phloroglucinol à 100 et 200 mg/I sans pour autant améliorer la croissance
des clones; par contre l'incorporation de glutamine améliore nettement non seulement la
survie des feuilles mais encore augmente le nombre moyen de pousses développées par
expiant.
L'enracinement obtenu est meilleur à la suite du traitement au phloroglucinol où 60% des
pousses s'enracinent sur milieu MS +AIB 5 mg/L. Ces résultats viennent corroborer ceux

110
obtenus sur le pommier par Jones (1976) qui a mis en évidence l'action juvénilisante du
Phloroglucinol grâce à une nette amélioration du taux de prolifération de clones agés.
H)
le taux de multiplication
Comme la plupart des ligneux sahéliens qui sont trés récalcitrants à la multiplication
végétative (Sadji et al.,1 992), Acacia albida présente un taux de multiplication
relativement faible. La stimulation des méristèmes en présence d'une forte concentration en
cytokinine (SAP) est nécessaire pour activer la formation de nombreux bourgeons axillaires
à partir d'un seul. En opérant un pré-trempage dans une solution
contenant une forte
concentration en SAP, il est possible d'améliorer le rendement de la culture"in vitro" en
multip.liant le nombre de bourgeons formés par 4 ou 5.
- Chez Acacia koa (Skolmen, 1986) seules des concentrations élevées (15 mg/I) en
cytokinine (SAP, 2iP, Zéatine) sont capables d'induire une multiplication du bourgeon
axillaire. Ce même phénomène a été observé chez Dalbergia latifolia (Rao, 1985) et
Prosopis alba (Tabone et al., 1986) où de fortes stimulations en SAP sont nécessaires à la
multiplication du bourgeon .
Ces résultats montrent toute la dificulté d'obtenir un taux de multiplication
supérieur à 1 chez les ligneux sans une forte stimulation en cytokinine ; cependant il faut
noter que chez Eucalyptus sideroxylon par contre, les tissus adultes rajeunis par recépage
réagissent plus favorablement à de faibles concentrations en SAP (Surger,1 987).
1)
l'enracinement
Nous avons montré lors de cette étude que l'enracinement qui est souvent une étape critique
dans le cadre de la micropropagation d'arbres adultes, est tout à fait possible chez Acacia
albida . Le taux optimal d'enracinement est obtenu sur un milieu M-S + AIS 5 mg/I avec un
délai de réponse organogène court de 1 1 jours.
Les recherches effectuées avec de
nombreuses espèces ont montré que la capacité d'émettre des racines adventives à partir de
segments de tiges diminue avec l'âge; souvent des traitements rajeunissants ont utilisés
pour améliorer le taux d'enracinement. Ces résultats illustrent toute la difficulté
d'enraciner du matériel adulte même rajeuni (Franclet, 1981).
J) Le phénomène de croissance épisodique
L'excision des explants des tissus maternels n'est pas aussitôt suivie d'une croissance car les
explants subissent une période de latence de durée plus ou moins variable en fonction de
l'état du matériel végétal. En moyenne et en l'absence de tout traitement, la période de latence
dure 7 à 10 jours au bout desquels le bourgeon se gonfle et la tigelle commence à émerger.

111
Des travaux sur des clones de Betula (Mc Cown et Mc Cown, 1987) ont montré que la durée
de la phase de quiescence est proportionnelle au degré de maturation des tissus originels.
Les explants issus de tissus matures d'A. albida produisent une pousse feuillée qui s'allonge
lorsque les conditions sont favorables. Au bout d'une période allant, de 30 à 45 jours, la
croissance est arrêtée, les feuilles jaunissent et leur chute débute à la base de la tigelle pour
gagner les feuilles supérieures. Ce phénomène peut être atténué en contrôlant la composition
du milieu de culture mais l'abscission ne peut en aucun cas être arrétée. La tigelle dépourvue
de feuilles ne s'accroit plus pendant 5 mois malgré les repiquages fréquents dans des milieux
neufs. A partir du 6ème mois, la tige commence à se re-déployer et quelques feuilles
apparaissent au sommet.
Il apparaît ainsi que les explants subissent une croissance épisodique suivie d'une phase de
quiescence durant une période pour reprendre un nouveau cycle de croissance.
Ce phénomène a été déja décrit chez un certains nombre d'espèces forestières ligneuses (Mc
Cown et Mc Cown, 1987) . En effet il est apparu sur Amelanchier, Betula , Quercus et Ulmus
que cette croissance épisodique est plus accentuée lorsqu'il s'agit de tissus matures (chez
Quercus, cette variation cyclique peut durer plusieurs années) ; en effet ils ont constaté
qu'avec des explants juvéniles, l'amplitude et la fréquence de cette évolution épisodique sont
faibles et le phénomène est plus amorti.
D'apres leurs observations, les auteurs ont distingué 3 phases dans l'évolution de la culture:
- une première phase d'isolement de l'expiant où la réponse morphogénétique est
directement liée à l'état physiologique et ontogénétique du rameau dont il est issu; si le
rameau se trouve dans une période favorable, le débourrement et la croissance du bourgeon
sont trés rapides, les tigelles formés sont trés vigoureuses et de bonne qualité. Cependant
cette phase est de courte durée puisqu'elle est le résultat de l'expression du bourgeon isolé
des tissus de la plante-mère.
- une seconde phase qui est une phase en plateau durant laquelle la tigelle entre dans
une phase de quiescence, la croissance est ralentie, aléatoire ; au cours de cette seconde
phase,
l'environnement physico-chimique et nutritionnel de la culture joue un rôle
prépondérant. Elle peut durer plusieurs mois.
- une troisième et dernière phase appellée phase de production durant laquelle les
cultures sont entièrement stabilisées, la croissance des tigelles est continue et leur aspect
est homogène. Ce n'est que lorsque les plantules sont bien installées dans cette phase qu'on
peut rééllement
envisager une production à grande échelle qui sera suivie de l'enracinement et de
l'acclimatation.
L'observation et l'étude des modalités de croissance en conditions naturelles
permettent de prévoir le comportement ultérieur des explants au cours de ces differentes
phases de culture. Car il a été constaté que généralement les espèces végétales dont le modèle
de croissance est caractérisé par un développement continu (quelques soient les conditions

112
environnementales) traversent trés rapidement ces différentes phases. Ainsi les plantes
herbacées, les plantes annuelles et les semis se stabilisent trés rapidement en culture "in
vitro". Par contre les plantes telle que A. albida qui ont des rythmes de croissance variables
en fonction des saisons avec des périodes de croissance épisodique suivies de phase de repos,
sont les plus difficiles à stabiliser "in vitro". DL!' fait de l'existence de contrôles internes
physiologiques et indépendants de l'environnement, toute tentative visant à faire évoluer les
explants vers une stabilisation totale s'est souvent révélée infructueuse.
Au cours de notre étude, nous n'avons pas pu atteindre le niveau de stabilité et d'homogénéité
préalable à une production massale de vitroplants ; les explants ont conservé le rythme de
croissance lente et aléatoire dans leurs cellules méristématiques et il serait difficile de
prédire à quel moment l'expiant sortira de cette phase.

MICROPROPAGATION
CHEZ
A. albida
PLANCHE
Wl0
. Matériel utilisé en vue de la regénération "in vitro" à partir
d'arbres
adultes
Fig A: Drageons se développant au pied de l'arbre en continuité avec le système
racinaire de la plante; ces drageons se forment trés fréquemment chez Acacia
albida .
.fuL.6.: Rejets formés sur le tronc de l'arbre à la suite d'une taille de ce dernier
Fig C: Pousses florifères récoltées sur les arbres au moment de la floraison

A

PlANCHE N° 11
Regénération "in vitro" d'A. albida adulte. à partir de nœud issu
de drageons
Fig.A: Nœud portant un bourgeon axillaire entre les épines stipulaires au moment
de la mise en culture sur un milieu contenant du charbon actif
Fig.B: Débourrement du bourgeon axillaire et sortie de la
première paire de
pinnules
Fig.C: Elongation du bourgeon axillaire en tigelle
Fig.D: La formation de nouvelles racines suit la sortie des feuilles au
cours de la phase d'élongation

A
B

PLANCHE
N° 12
Défoliation des tigelles d'A.
albida "in vitro"
Fig.A: Au bout de 30 jours de culture on constate un jaunissement des feuilles à
partir de la base suivie d'une abcission foliaire.
Fig.B: A la suite d'un traitement au Phloroglucinol (1 g/l), la croissance et
l'enracinement des tigelles sont améliorés.

@..
A
B

PLANCHE
N° 13
Intensification
de
la
multiplication
des
bourgeons
axillaires
issus de matériel adulte
Fig.A : A partir d'un expiant primaire, en présence de Bap (2,Smg/L), la
regénération ne permet d'obtenir qu'un~ seule pousse feuillée.
Fig.B: A la suite d'une stimulation du bourgeon axillaire par trempage des nœuds
dans une solution concentrée en BAP (20 mg/l), 3 bourgeons (fléches) sont
initiés
par multiplication du méristème axillaire.

A
B

PLANCHE
W 14
Enracinement
"in
vitro"
des
tigelles
d'A.
albida et influence
de
la
nature de l'auxine
Fig.A : Enracinement sur milieu MS + AIB
Fig. B : Enracinement sur milieu MS + ANA
Fig.C: Enracinement sur milieu MS + AIA

®
A
8

Tabl N° 39 : Influence de l'AIA sur la réponse organogène d'hypocotyles d'A. albida au bout de 7 , 17 et 25
jours de culture sur milieu Gamborg.
7 jours de culture
AIA
nbre total
caulogénèse %
Rhizogénèse %
exolants
o mg/I
15
0
0
19
3 mg/I
15
0
33%
15 mg/I
15
0
25%
17 jours de culture
AIA
nbre total
caulogènese
Rhizogénèse
explants
Nbre
%
Nbre
%
o mg/I
15
0
0%
0
0%
3 mg/I
15
3
20%
7
46%
15 mg/I
15
0
0%
8
53%
25 jours de culture
AIA
nbre total
caulogènese
Rhizogénèse
explants
Nbre
%
Nbre
%
o mg/I
15
5
33%
0
0%
3 mg/I
15
4
26%
7
46%
15 mg/I
15
0
0
15
100%
Tab!. N° 40: Morphogénèse à partir de divers explants d'A. albida en fonction de trois concentrations en
2-4D au bout de 30 jours de culture sur milieu Gamborg
1type expiant
2-4D
nbre expiant
cal
racines
embryon excisé
1mg/I
15
100%
0%
3mg/1
17
100%
0%
6mg/1
19
100%
0%
hypocot+ épic
1mg/I
12
50%
0%
3mg/1
14
80%
0%
6mg/1
13
0
0%
hypoc + radic
1mg/I
15
50%
0%
3mg/1
14
80%
0%
6mg/1
16
0
0%
cotylédons
1mg/I
21
40%
10%
3mg/1
25
55%
0%
6mg/1
29
100%
0%

113
2 -EMBRYOGENESE
SOMATIQUE
2-1)
Callogénèse
2-1-1) Influence de l'AIA
Nous avons cherché au cours de cette expérience à induire la formation de cal en utilisant une
auxine naturelle l'AIA.
Le matériel de base utilisé dans cette expérience est constitué de fragments d'hypocotyles d'1
cm de long. 3 concentrations
en AIA (0, 3 et 15 mg/I) ont été testées sur le pouvoir
callogéne.
Les résultats sont confinés sur le tableau N°39 .
Sur un milieu totalement dépourvu d'auxine, la reaction des explants est trés lente et
on n'observe aucun signe de callogénèse. Par contre, des bourgeons se forment au bout de 25
jours de culture. Avec des doses plus élevées d'auxine (3 à 15 mg/L), des racines adventives
apparaissent vers le pole distal de l'hypocotyle alors que vers le pole proximal de
l'hypocotyle proche du collet, se forment des bourgeons adventifs.
Les racines néoformées sont trés longues, fines et se développent bien dans le milieu.
L'AIA ne permet pas la formation d'un cal préalable à une embryogénèse somatique;
par contre elle est· une excellente auxine pour induire une rhizogénèse et une caulogénèse
adventive chez A. albida .
Il est intéressant de noter l'existence d'un important potentiel organogénètique chez A. albida
car sans apport exogène de cytokinine l'espèce est capable de regénèrer à partir de fragments
d'hypocotyles.
2-1-2) Influence du 2-4 0
L'AIA ne pouvant pas induire la formation de cal chez Acacia albida, nous avons été
amenés à utiliser une auxine plus forte notamment le 2-40 qui a été utilisé à des
concentrations variant entre 0, , 1 et 3 et 6 mg/I ainsi qu'une solution constituée d'un
mélange d'acides aminés et utilisé à 3 concentrations (0,5, 1 et 2 mg/I) (tabl. N° 40). Les
explants sont d'origine diverse: des fragments de foliolules, des embryons excisés, des
fragments de pétiole, de cotylédons et d'hypocotyles .
La callogénèse est
importante lorsque les explants sont placés sur des milieux
contenant 1 mg/I de 2-40 ; on obtient en effet 75 à 100% d'explants callogénes au bout de
20 jours de culture; les explants les plus callogènes sont les portions d'hypocotyles et

116
sont à l'origine des embryoïdes au tout début de leur phase d'evolution. En effet, ces amas
cellulaires se divisent et évoluent en passant par les différentes étapes comparables à celles
observées lors de l'embryogénèse sexuée (stade globulaire, cordiforme et torpille).
On peut observer l'élaboration d'un axe embryonaire au stade globulaire (PI N° 16 fig
N°A ), et lorsque les méristémoides sont cordiformes et torpilliformes, la différenciation
s'effectue en deux pôles opposés, le pôle caulinaire et le pôle racinaire (pl N° 16 fig B).
Il apparait, au vu de ces observations, que des structures embryogénes se sont
différenciées au sein du cal en empruntant la voie normale (globulaire, cordiforme, torpille
etc... ) mais ces structures embryoniques n'ayant pas trouvé de conditions adéquates de
germination, sont restées bloqués à ce stade.
En effet, le transfert des cals sur un milieu dépourvu d'hormones et contenant de
l'hydrolysat de caséine considéré comme substance généralement indispensable à
l'embryogénèse somatique, n'a pas produit d'effet positif sur l'évolution ultérieure des cals.
D'autre part, la culture de ces cals a duré 21 semaines au bout desquels nous avons sacrifié
ces cals pour en déterminer la structure histologique ; il a été observé sur les coupes un
début de dissociation des embryoides de la masse indifférenciée du cal qui devrait, si la
culture était poursuivie, aboutir à la libération les embryoides.
2-3) Discussions
Chez A. albida, l'induction de cals embryogénes est possible à partir de tissus cotylédonaires.
Comme chez Acaca koa (Skolmen et Mapes, 1976) à partir de tissus hypocotylaires, les cals
d'A. albida développent en effet des nodules méristématiques qui présentent les différents
stades morphologiques caractérisant l'évolution ontogénétique d'un embryon somatique
(globulaire, cordiforme, torpille et enfin embryon avec cotylédons ).
Ces structures embryoides évoluent de manière similaire aux embryons zygotiques.
Chez A.
albida comme chez Hevea
braesiliensis
(Carron et al., 1984), le
vieillissement du cal semble être une condition favorable à l'induction embryogéne.
La germination qui constitue une étape critique dans le processus de maturation des
embryons n'a pas pu se réaliser chez A. albida. Skolmen (1986) sur Acacia koa a rapporté la
difficulté d'obtenir des plantules à partir des embryons formés. En cherchant à pallier à
l'absence de stimuli d'origine cotylédonaire, il a ajouté 1% d'extrait de cotylédons; en fait,
parmi tous les traitements appliqués sur les embryons ( réduction de la pression osmotique
du milieu de culture, augmentation de la teneur en lait de coco, en cytokinine et en auxine ),
aucun n'a réussi à lever l'inhibition exercée sur la germination de ces embryons. Chez A.
albida, le transfert des cals sur un milieu dépourvu d'hormones et contenant de l'hydrolysat
de caséine considéré comme substance généralement indispensable à l'embryogénèse

117
somatique et du charbon actif, n'a pas produit d'effet positif sur l'évolution ultérieure des
cals.
Cependant comme l'ont fait remarquer certains auteurs, (Sommer, 1980 et Sondhal et al.,
1978), l'étape finale de la maturation des embryons somatiques requiert un passage en
milieu liquide agité permettant de libérer ces structures embryoniques de la masse compacte
du cal. En outre chez Hevea braesiliensis (Carron et al., 1984) , il a été constaté qu'à la
suite de la dislocation des cellules parenchymateuses entourant le nodule méristématique, ce
dernier se libére progressivement pour émerger à la surface du cal et produire des
embryons normalement constitués qui germent rapidement.

PLANCHE
W15
Organogénèse à partir de cals d'A. albida
Fig.A: Callogénèse sur fragments de cotylédons aprés une induction sur un milieu
contenant du 2-40 .
Fig.B: Cal cotylédonaire organogéne produisant des racines adventives.
Fig.C et 0 : Cal cotylédonaire organogéne produisant des bourgeons adventifs
évoluant par la suite en pousses feuillées.

,~
( 15 ')
~'
B

E MBRYOGÉNÈSE
SOMATIQUE À
PARTIR DE CALS COTYlÉDONAIRES
D'A.
ALBIDA
Fig.A : Embryoide developpé sur cal cotylédonaire d'A. albida au stade globulaire :
l'embryoïde se trouve inclus dans la masse du cal constitué de grandes cellules
trés vacuolisées; au sein de cette masse se différencie et s'organise une structure
de forme globulaire constituée d'un ensemble de cellules de petite taille trés
colorées. _
Ces cellules s'organisent autour d'un axe polarisé médian (
)qui déterminera
ultérieurement le pôle caulinaire et le pôle racinaire. (Gr x 400)
Fig.B : Structure embryoide torpilliforme; la structure du pôle apical de tige est
bordée par les deux lobes cotylédonaires, le pôle radiculaire se forme.
PC : Pole caulinaire ; PR : Pole radiculaire. (Gr. x400)

@
A
B

Tabl N°44 : Influence de l'âge et de la longueur de la racine principale d'A. albida sur l'aptitude à
produire des bourgeons adventifs à partir d'explants racinaires cultivés sur milieu M-S/2 pendant 45
jours.
Longueur de la
age des explants
Nbre explants
Bourgeonnement
Nbre
racine principale
(j)
total
Nbre
%
bourgeons/expl
5-9,5 cm
12
71
11/71
15
1,7 b
10-17 cm
19
69
35/69
50,7
3,3 a
17-25 cm
27
44
24/44
54,5
2,51 a
Tabl N°45 : Influence du diamètre des explants sur le taux de bourgeonnement adventif à partir de
segments-de racines d'A. albida cultivés sur M-S/2 pendant 7 semaines.
Matériel
nbre
%
diamètre racin (mm)
racines caulogenes
23/59
38,9
2,04 a
racines acaulogenes
36/59
61
1,5 a

118
3-
CULTURE DE RACINES EXCISEES
3 -, ) Description de' l'apparition des bourgeons végétatifs
adventifs
En réaction à la fragmentation de la racine et à l'ablation du méristème apical
racinaire, les
racines excisées développent au bout de 48 heures de nombreuses
ramifications latérales. Au bout de 7 jours de culture des fissures apparaissent sur toute la
longueur de l'expIant racinaire. (pl N°'7 fig A ) Ces fissures laissent apparaître un tissu
interne de couleur verte. En présence de lumière, les tissus racinaires originels d'A. albida
non chlorophylliens se chargent en chlorophylle. A partir de ces tissus racinaires,
des
ébauches de points végétatifs émergent (pl N°' 6 fig B ). Ces ébauches, souvent de couleur
rouge, èn raison de la présence de pigments anthocyaniques, évoluent en bourgeons bien
individualisés puis en pousses feuillées (pl N°' 6 fig C ).
3-2 )Influence de la position de l'expiant sur la racine
En numérotant les segments de racines en fonction de leur position initiale respective sur la
racine (fig N° 22), on s'aperçoit que l'intensité de la réponse organogénétique décroît
progressivement de la portion proximale vers la portion distale de la racine. En effet la
portion proximale, proche du collet constituée des 3 premiers cm est la zone la plus
organogéne. La fréquence relative du nombre de bourgeons formés à cet endroit est la plus
élevée (70%). Plus on se rapproche de l'apex racinaire, plus la fréquence décroît. Nous
avons aussi noté que les bourgeons apparaissent sur toute la surface de l'expIant racinaire
que cette surface soit en contact ou non avec le milieu de culture mais trés souvent à
l'extrémité proximale) (pl N°'8 fig N°A
).
3-3) Influence de la longueur ou l'âge de l'expIant
A la suite de la germination, les jeunes plantes sont pré-cultivées en tube sur un support de
perlite Ivermiculite
imbibé de milieu minéral de M-S 12. La
pré-culture d'une durée
variable, favorise la croissance de la plantule qui développe un système racinaire pivotant et
trés allongé. Les fragments de racines d'une taille moyenne d" ,5 cm ont été prélevés sur ces
plants pré-cultivés.
La pré-culture des racines pendant des durées variables (' 2 ; , 9 et 27 jours aprés la
germination) permet de différencier 3 catégories de plantules en fonction de la longueur de
la radicule:
'2 jours: longueur de racines comprise entre 5 et 9,5 cm
, 9 jours :
" "
, 0 et , 7 cm

Fig r'f22 : Influenco? do? la position ,jlJ fngrl1o?nt do? r."cine ,f ,4_ ~lbid~ SIJr l'aptitudo? à produire des bourgeons adventifs
"pr~.:: 30 j(lIJt-; d€' (;IJHun· ;;ur milieu t-j-S
,....
•.. - ...."
~.'
....
1,5 e..
3e.
4,5 e..
6e.
7ea
Fig r'r='23: 'hriabilité do? l'"ptitudo? do? diffo?t-o?nts (:lones d' A.iilbj,jii à produiro? d€'s bourgeons "dventif::: à partir de f3cino?s
€'xcisé€'s,
c1Jaivé€'s sur milieu 1+8/2 pendant 45 jours
224
6. 12
6.14
221
6.11
6.13
222
6.15
6.10

119
27 jours:
"
"
17 et 25 cm
Lorsque la radicule mesure entre 5 et 9,5 cm, le taux de regénération est faible (15%)
avec un nombre moyen de boUrgeons par expiant initial de 1,7. Avec l'augmentation de la
durée de pré- culture
(19 à 27 jours), le taux d'organogénèse s'accroît de manière
significative (54,5 %) avec un nombre optimal moyen de 3,3 bourgeons par expiant
et
certains explants présentent 8 à la bourgeons néoformés (tabl. N° 44). Il apparait ainsi que
l'augmentation de l'âge des explants primaires a un effet positif favorable sur l'expression
des potentialités organogénes chez A. albida.
3-4) Influence du diamétre de l'expiant
Les racines à diamètre élevé supérieur à 2 mm sont legérement plus sensibles à
l'induction caulogéne que les racines à faible diamètre qui sont en majorité faiblem~nt
organogènes. Il nous est apparu que c'est à partir d'une certaine taille (1,5 mm) de la racine
que l'expiant racinaire répond à la stimulation caulogéne (tab.45).
3 - 5) Influence du génotype de l'expiant
Differents génotypes issus de graines d'A. albida et dont les racines ont été mises en
culture, ont montré une grande variabilité dans l'aptitude à produire des bourgeons adventifs
(fig N° 23). Le nombre moyen de bourgeons par expiant de fragments de racines cultivés
dans des conditions identiques, varie de 0,2 bourgeons par expiant pour les génotypes peu
réactifs à 2,7 pour les génotypes les plus caulogénes.
3-6) Influence de la composition des milieux de culture
Quatre milieux de culture ont été testés en association avec plusieurs combinaisons
hormonales (tabl. N° 46,47 et 48 et fig N°24 ).
Les milieux M-S/2 favorisent un taux de caulogénèse élevé variant entre 57 et
90,5%. Quelle que soit la concentration en kinétine, le nombre moyen de bourgeons par
expiant demeure pratiquement constant.
Les milieux WPM ne favorisent pas l'expression morphogénétique de la totalité des
explants mis en culture. En effet, 21 à 45 % seulement des explants racinaires produisent
des bourgeons adventifs avec une intensité variant entre 1,2 et 1,8 bourgeon par expIant.
Les milieux 85 ne favorisent une expression morphogénétique optimale en présence d'une
teneur en kinétine faible (0,5 mg/I) ; en effet on constate que 72,7 % des explants
produisent en moyenne 2,57 boureons par expiant racinaire lorsque les explants sont
cultivés en présence de 0,05 mg/I de kinétine. Par contre, en présence de fortes
concentrations, le taux de regénération est plus faible (33% et 36%).

Tabl N°46 : Influence de quatre milieux de culture associés à la kinétine 0,1/ANA 0.01 mg/L sur
l'aptitude à produire des bourgeons adventifs à partir d'explants racinaires d'A. albida aprés 4S jours
de culture
Nbre total expl
expl organogenes
nbre moy bgeons
Intensité
1
Milieux de base
Nbre
%
par expiant
caulogéne
M5/2
21
19
90,5
1,84 a
1,66
WPM
20
9
45
1,66 a
0,747
B5
25
9
36
1,44 a
0,518
BOA
26
19
73
1,15 a
0,839
Tabl N°47 : Influence de quatre milieux de culture associés à la kinétine O,2/ANA 0.01 mg/L sur
l'aptitude- à produire des bourgeons adventifs à partir d'explants racinaires d'A. albida aprés 4S
jours de culture
Nbre total expl
expl organogenes
nbre moy bgeons
Intensité
1
MILIEUX de base
Nbre
%
par expiant
caulogéne
M5/2
16
9
57
1,75 a
0,997
WPM
13
5
38,5
1,2 a
0,462
B5
18
6
33,3
la
0,333
BOA
18
11
61,1
l,la
0,672
Tabl N°48 : Influence de quatre milieux de culture associés à la kinétine 0,05/ANA 0.01
mg/L sur l'aptitude à produire des bourgeons adventifs à partir d'explants d'A. albida
aprés 4S jours de culture
Nbre total expl
expl organogenes
nbre moy bgeons
Intensité
1
Milieux de base
Nbre
%
par expiant
caulogéne
M5/2
21
13
62
1,63 b
1,01
WPM
19
4
21
1,4 b
0,294
B5
11
8
72,7
2,57 a
1,868
BOA
21
12
57
1,26 b
0,718

F~ lf24: Inl11Jj!Ilr;~ .le 'llJ~1t-e 111~1J.."{ ,i~ .;lJlt1m ~$5J)cié5 à la kiMt~ [0,05 l11l?il; O.1l11l?il; 0,2 mg/Il ~t U'ANA (0.01
l11~I'IJ $1.11 rÏlLt~n:::it~ d~ la ';'U11oénb "ÏlL 'litt·c'" àl'il/tir .l~ fY'.<.g.m.~nts ll~ r.\\\\~ÏlL~5 d'A. •tkSl.i.f.! i1.l't"fs 45 jOl,\\t"$ de c1.ùl1ffe
0.. (1=:0,1]
2
::
0:.: (KO,2)
?'"
.:::
Il rKO,05)
.......:l,~
]

Tabl. N° 49 : Influence de differentes concentrations en auxine en l'absence de cytokinine sur la
stimulation de la réponse organogéne à partir de tissus racinaires chez A. albida aprés 30 jours de culture.
Nbre total explants
explants organogenes
nbre moy bourgeons
- - - - - - - - : - - - - t
concentrat (mg/I)
Nbre
%
par expiant
BAP a/ANA a
19
7
36,8
1,28
BAP a/ANA 0,05
25
7
28
1,14
BAP a/ANA 0,1
24
5
20,5
1,00
BAP a/ANA 0,2
29
11
52
1,12
Tabl N°50 : Influence de la Zéatine (combinée avec l'ANA 0.01 mg/L) sur l'organogénèse''in vitro" à partir de
racines excisées d'A. albida ; les résultats ont été obtenus aprés 35 jours de culture
Nbre total
explants organogenes
nbre moy bourgeons
explants
1 concentrat (mg/I)
Nbre
%
par expiant
Zeat 0,1 mg/I
14
7
50,0
1 a
Zeat 1 mg/I
14
8
57,1
1,25 a
Zeat 5 mg/I
14
8
57,1
1,37 a
Tabl N°51 : Influence de la kinétine (combinée avec l'ANA 0.01 mg/L) sur l'organogénèse''in vitro" à partir de
racines excisées d'A. albida ; les résultats ont été obtenus aprés 35 jours de culture
Nbre total
explants organogenes
nbre moy bourgeons
explants
1 concentrat (mg/I)
Nbre
%
par expiant
Kinet 0,05
21
13
62
1,63 a
Kinet 0,1
21
19
90,5
1,84 a
Kinet 0,2
16
9
57
1,75 a
Kinet 5
16
11
68,7
1,45 a
kinet 10
14
5
35,7
1,2 a

120
Les milieux BOA sont favorables à la caulogénèse mais le nombre de bourgeons formés
est en général faible.
En associant ces quatre milieux minéraux à 3 combinaisons hormonales, (Kin 0,05; Kin 0,1
g/I; Kin 0,2 mg/l) et en présence d'ANA 0,01 mg/I) on constate que (Fig 24):
- l'optimum de l'intensité caulogéne sur milieu B5 n'est obtenue qu'en présence de la
Kinétine 0,05 mg/l/, ANA 0,01 mg/!. En effet, lorsque les concentrations hormonales
augmentent, l'intensité caulogène diminue.
- Sur milieu M-S/2 quelles que soient les concentrations hormonales utilisées, l'intensité
caulogéne obtenue est supérieure à celle de la plupart des traitements.
- En présence des milieux WPM et BOA, l'intensité caulogéne est souvent faible.
3 -7) Influence des substances hormonales
3-7-1) les Cytokinines et la caulogénèse
- Milieu témoin dépourvu de cytokinine
Nous avons constaté (Tabl 49) qu'en l'absence de toute stimulation hormonale de nature
cytokininique exogéne,
les explants racinaires réagissent naturellement à l'excision de
l'apex racinaire en produisant des bourgeons. Le pourcentage d'organogénèse est cependant
faible, il varie entre 20 et 52% avec un nombre moyen de bourgeons qui dépasse rarement
( 1 ,2).
- Zéatine
Lorsque la concentration en zéatine (Tabl N° 50) varie entre 0,1 et 5 mg/l, le taux de
caulogénèse ne varie pas alors que le nombre moyen de bourgeons augmente légèrement.
- Kinétine
La concentration optimale de kinétine (Tabl N° 51) permettant une meilleure expression de
l'organogénèse "in vitro" chez A. albida est une concentration équivalente à 0,1 mg/l où 90%
des explants forment en moyenne 1,84 bourgeons par expiant; lorsque la concentration en
kinétine augmente, l'intensité de la réponse diminue.
- BAP
Trois concentrations en BAP (5,10 et 15 mg/I) (Tabl N° 52) ont été testées sur
l'organogénèse "in vitro" chez A. albida. L'optimum de réponse est obtenu en présence de
10mg/1 où 100% des explants produisent une moyenne de 1,7 bourgeons par expiant. Une
forte teneur en BAP du milieu (15 mg/I) est inhibitrice de l'expression caulogéne des
racines d'A. albida.

Tabl N°52 : Influence de la SAP (combinée avec l'ANA 0.01 mg/L) sur l'organogénèse''in vitro" à partir de
racines excisées d'A. albida ; les résultats ont été obtenus aprés 35 jours de culture
Nbre total expl
expl organogenes
nbre moy bgeons
. - - - - - - - - - - - l
concentrat (mg/!)
Nbre
%
par expiant
SAP 5
12
6
50
1 a
SAP 10
12
12
100
1,7 a
SAP 15
14
11
78,5
1,5 a
Tabl N°53 : Influence de 2iP (combinée avec l'ANA 0.01 mg/L) sur l'organogénèse''in vitro" à partir de racines
excisées d'A. albida ; les résultats ont été obtenus aprés 35 jours de culture
Nbre total expl
expl organogenes
nbre moy bgeons
. - - - - - - - - - - - l
concentra~ (mg/I)
Nbre
%
par expiant
2iP 5
11
10
90,9
2,11 a
2iP 10
13
4
30,7
2a
Tabl N°54
Influence antagoniste des cytokinines sur la formation des racines latérales et sur la
caulogénèse au moment de mise en culture des explants racinaires sur les differents milieux
hormonaux
cytokinine
concentration
% caulogènése
% racines
nbre de racines
latérales
par expiant
Kinetine
5 mg/I
68,7
45
1,5 c
10 mg/I
35,7
53,8
1,23 c
SAP
15 mg/I
78,5
7
0,07
1°mg/I
10O
36
0,63 c
5 mg/I
50
2 iP
5 mg/I
90,9
°
60
2,1 °
b
10 mg/I
30,7
92,30
2,3 b
zeatine
0,1 mg/I
50
69,20
3,84 a
1 mg/I
57,10
75
4,33 a
5 mg/I
57,14
30
0,7 c

121
- 2 iP
Nous avons testé deux combinaisons hormonales 5 et , 0 mg/I de 2 iP (Tabl N° 53).
A 5 mg/l, 90% des explants produisent 2,"
bourgeons par expiant; lorsque la teneur en
2iP est élevée à , 0 mg/l, le nombre d'explants qui forment des bourgeons diminue mais sur
les explants réactifs, le nombre moyen de bourgeons formés est optimal (2,5).
La figure N° 25 résume l'influence de la concentration des diverses substances hormonales
utilisees sur l'intensité de la caulogénèse exprimant le produit du nombre moyen de
bourgeons formés par explants par le pourcentage de caulogénèse. On se rend compte que
l'intensité caulogéne maximale est obtenue en présence de 2iP 5mg/1.
D'une manière générale, la comparaison de ces diverses combinaisons hormonales à
differentes concentrationsmontent (fig 25) que l'addition de 2iP à 5 mg/I favorise une
intensité caulogéne optimale.
3-7-2) Cytokinines et formation de racines latérales
Les cytokinines sont des hormones connues pour être des antagonistes de la rhizogénèse. Chez
A. albida, l'action inhibitrice des cytokinines
sur la formation de racines latérales aprés
l'excision de l'apex, se manifeste de manière nette (tabl. N° 54) en présence de fortes
concentrations de BAP où seul 0 à 0,63 racines en moyenne sont formées.
La kinétine présente elle-aussi un effet inhibiteur sur la formation de racines
latérales bien que l'effet soit moindre par rapport à celui de la BAP.
L'action antagoniste de l'hormone 2iP sur la formation de nouvelle racines latérales
est beaucoup moins importante que les deux précédentes substances hormonales (pl N°' 8 fig
N°B ). En effet, une moyenne de 2,' à 2,3 racines par expiant est formé au cours de la
culture et les bourgeons se forment à l'aisselle des racines latérales.
La zéatine à faible concentration (0,' et , mg/I) stimule la rhizogénèse adventive avec une
moyenne de 3,8 à 4,3 racines par expiant. Cependant lorsque la teneur en zéatine augmente
(5 mg/I) on assiste à une inhibition du nombre d'explants développant des racines et du
nombre moyen de racines formées.
3-8) Substances à action cytokinigue
3-8-') Phényl-urée
Des fragments de racines d'A. albida ont été mis en contact avec un milieu contenant de la '-3
DPU à des concentrations variant de , à 50 pM/L (Tabl. N° 55 ; Fig 26).

Fiq. l-r25: !IIl1u.eIlCl! di! 4 qltükÎIliIl.ol$ fmlÏlll!, kÏlll!tÏlll!., Bap, 2iP) à. di\\rerm CüIlCudt'alioIiS com.~inèes àrAliA (OJOi m.gl'l) S1Jl"
l'iD.teIi$ité de 1'\\ ca\\lk.géll.èse "Î1l. vitro" à pmir de f~ell.ts ole racÎ1l.es d'A. ;J1AQb. c1.Ùti'~$ SW' 1.1.11. milieu de base (1'/18/2) ap~s 35 j01Jts de
,:ullllt~. L~ milliu t~moÏ1l. ~5t Il~pOUf'f1II~ 1!1jtok~ lUis I!On.t~nt I~ l'ANA 1),2 m.~n
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~
.~
.~
Ci:) Infensité de la ç.~lJlogénèse =% d'explants '~'J.:mt réagi à la stimlJlahon x Nombre mO'Jen de bOlJrgeons formés par explanf

122
L'élevati~n de la teneur en l-3DPU du milieu de culture favorise un accroissement du taux
de caulogénèse. En effet, (fig N° 26) le pourcentage d'explants caulogénes passe de 50% en
présence d' 1pM de DPU à 81,5% en présence de sOpM. Le nombre moyen de bourgeons
formés évolue dans le même sens avec une amplitude d'accroissement trés faible.
3-8-2) Polyamines
Trois polyamines ont été testées (Tabl. W56; fig 27) sur les capacités organogénétiques des
racines d'A. albida "in vitro". Il est apparu que la culture en présence de spermidine et de
putrescine à 10p M permet à la majorité des explants (100% et 93 % respectivement) (fig
N° 27) de produire des bourgeons. Si on considère le nombre de bourgeons produits par
expiant racinaire, on constate qu'en présence de spermine 10p M, un nombre optimal de 2,8
bourgeons est formé; sur ce milieu il n'est pas rare de compter 8 à 10 néoformés par
expiant. Cependant certains bourgeons émergent à partir d'un cal abondant (pl N°18 fig C ).
La particularité intéressante notée sur ces bourgeons obtenus en présence de polyamines,
demeure leur vigueur et leur croissance très rapide.
3-9) Efficience des diverses substances à action cytokinigue
L'efficience relative des différentes substances utilisées sur les racines excisées d'A. albida
est déterminée par l'intensité de l'expression morphogénétique (nombre de bourgeons
formés par segment de racine).
Si on compare les cytokinines (fig N° 28) (BAP, kinétine, zéatine, 2iP), on constate que
parmi toutes ces cytokinines utilisées le 2iP est la plus efficiente sur la caulogénèse chez A.
albida ; cette hormone agit à des doses variant entre 20 et sOpM. Pour une efficience
similaire, la kinétine agit à de trés faibles concentrations de l'ordre de 100 fois moindre que
celle du 2 iP ; l'augmentation de sa teneur réduit l'intensité de la réponse caulogéne.
La BAP n'agit efficacement sur l'organogénèse chez A. albida que lorsqu'il est présent en forte
concentration (45pM) ; la zéatine hormone naturelle est peu active sur la caulogénèse chez
A. albida .
En comparant les polyamines et phényl-urées (fig N° 29) avec les cytokinines utilisées, on
se rend éompte que la DPU et la BAP ont des spectres d'action voisins (entre 50 et 100
pM/L) car la DPU agit à des doses proches de celles de la BAP. La kinétine par contre agit à
des doses beaucoup plus faibles de l'ordre de 2 pM IL pour une plus grande efficience; les
polyamines spermine et spermidine sont trés efficaces
à 10 pM ; à 100 pM leur action
devient inhibitrice de la caulogénèse puisque le nombre de bourgeons formés est réduit
considérablement.

TabI.N°55: Influence d'une phenyl-urée (1-3 DPU) associée à l'ANA 0.01 mgIl sur l'intensité
de l'organogénèse "in vitro" à
artir de rra ments de racines d'A. albida
Nbre total explants
explants organogenes
nbre moy bourgeons
Nbre
%
par expiant
DPU 1J.1M/I
31
16
51,6
1,06 a
DPU 2J.1M/I
31
21
67,6
1,47 a
DPU 5J.1M/I
39
23
59
1,34 a
DPU 10J.lM/I
2_9
2_1
7_2..,:.,4
1..:..,4_7_a
_
DPU 50J.lM/II
28
2_2
8_1..,:.,_5
--"1,_6_4_a
_
TabI.N°56: Influence de 3 Polyamines associées à l'ANA 0.01 mg/l sur l'intensité de
l'organogénèse et le nombre de bourgeons adventifs formés "in vitro" à partir de
fragments de racines excisées d'A. albida aprés 45 jours de culture
Nbre total
explants organogenes
nbre moy bourgeons
explants
Nbre
%
par expiant
Putrescin 10-4 M
11
6
54,5
1,5 b
Putrescin 10-5 M
14
13
93
1,23 b
Putrescin 10-6 M
11
9
82
1,1 b
Spermine 10-4
20
4
20
1,3 b
Spermine 10-5
19
19
100
2,8 a
Spermine 10-6
13
8
61,5
1,25 b
Spermidine 10-4
22
16
72,7
1,28 b
Spermidine 10-5
18
14
78
1,81 b
Spermidine 10-6
15
4
26,6
1,26 b

Fi;.; U'Z6 : Iril11J.~Me de la 1-3, Di-F'1.éIl.~rl-Ut·~~ sW'l'iILt~b5ité d~ la ,;~.\\I1oéJJ.ès~ "in. vitt"o" à l'~ttir ~ ft"~enl5 d~ t~c~s e::roisé~5 d'A.
~d.<lMI c\\ùti,,4s 51.1".. milie\\l IvJS/2 penwllt 2S j01Jn:.
-
1.5 <i
Fig lof2?: Iril1u.uu:e oL! 3 polya.m.ÏIu!z (PutrezcÏIu! Sperm.iIœ ~t Sperm.îdiM) ;. di'!~rm cOILC~nlt"al:ion:> zUt" l'inlen:>ité ~ 13. c:l.ulo~~ze ;. p:utir
de iraf,llle1Lt> de ra.cines exçi>ées d' A. dht.~ çlJlti'Yés re1Lwllt 45 jQ\\11'$
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Fig 1'·1'"28:
Comparaison de l'efficience relathre des differentes·substarlCes de croissaIlCe utilisées (CytokinuLes) sur
l'a.ptitIJ.de c(l.lJlogéne des racines excisées d'A. iyr..ii,'i
.
3-.----------------------------.,
Fig N"Z9:
Comparaison de l'efficience relative des differentes su.bstmtces de croisstmce utifuées (Pol):amines ,1-3
DPU) surI' aptitude caulogélLe des racÏlLeS excisées dIA. iY!litfL.1
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Putrescine
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40
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80
100
1~

123
3-10) Maintien du
pouvoir caulogéne
A partir d'une racine, il est possible dans les conditions optimales de regénérer en moyenne
32 pousses enracinées au bout de 2 mois de culture. Aprés une induction de 7 jours sur un
milieu riche en cytokinine, nous avions procédé à un transfert des segments de racines sur
un milieu faiblement concentré en cytokinine pour éviter une éventuelle accumulation de
cytokinine dans les tissus, qui inhiberait l'expression de la caulogénèse.
Par la suite de nos expériences, aprés avoir déterminé les conditions optimales· de la
caulogénèse, nous avons utilisé des milieux additionnés de SAP (5 mg//) et de Spermidine
10pM ; les explants y sont placés en permanence durant toute la culture;
nous n'avons
jamais observé un inhibition de la caulogénèse sur ces explants. En effet, 90 jours aprés la
mise en culture, aprés que les pousses allongées soient mises à enraciner, nous avons encore
trouvé de nouveaux bourgeons qui se formaient au sein des tissus racinaires.
La mise en place permanente des explants sur un milieu inducteur,
favorise une
organogénèse continue; à la suite de l'excision des premiers bourgeons formés qui ont évolué
en pousses feuillées, d'autres bourgeons se forment à leur tour.
3-11) Enracinement
Les pousses développées sur les différents milieux de culture sont trés vigoureuses
(pl N°20 fig WA )et leur croissance est rapide. Aprés excision et culture des pousses sur
des milieux contenant des auxines à différentes concentrations (AJA 0,1 mglL, AIS 0,1 mg/l
et un mélange de AIA 0,05 mgll et AIS 0,05 mg Il ) (Tabl. N° 57). Le taux d'enracinement
obtenu (87%) est identique sur les trois milieux utilisés; le nombre moyen de racines
formés est cependant variable puisque c'est le milieu contenant de l'AIS à 0,1 mg Il qui
favorise la formation du nombre le plus élevé de racines adventives (pl N°20 fig N°S); les
tigelles produisent au bout de 14 jours des racines sans une formation de cal basal.
3-12) Histologie des bourgeons adventifs
Le fragment de racine mis en culture, dés la première semaine se fissure et se charge de
chlorophylle; l'émergence du bourgeon se fait à la suite de l'éclatement des tissus
superficiels constitués par le rhizoderme ; le tissu cortical adjacent au rhizoderme, devient
visible ; il est constitué de plusieurs assises de cellules parenchymateuses de grande taille.
On distingue deux voies morphogénétiques de formation de bourgeons adventifs:
- Au sein du cortex interne, constituée de parenchyme fondamental, se différencient
quelques cellules au contour arrondi, de petite taille et au contenu cytoplasmique dense.
Les tissus racinaires évoluent progressivement vers une structure de tige. En effet, le
premier signe d'une évolution vers une structure caulinaire est le fait que la zone corticale
interne, réduite aux cours des premiers jours, prend de plus en plus de l'importance, et se

Tabl. N° 57 : Influence des auxines (AIA et AIB) sur la rhizogénèse "in vitro" à partir de tigelles issues de
bourgeons adventifs des racines excisées d'A. albida et cultivées pendant 30 jours sur milku M-S/2 .
Nbre total
explants organogenes
nbre moyen racines
explants
1
concentrat (mg/!)
Nbre
%
par expiant
AJA 0,1 mg/I
14
12
85,7
1,91 b
AIB 0.1 mg/I
14
12
85,7
4,6 a
AIA(0.5)+AIB (0,5)
16
14
87
3,4 a

124
développe considérablement au dépens de la zone corticale externe qui à son tour devient tres
réduite; cette région est constituée de cellules parenchymateuses abondamment remplies de
subtances de réserves.
C'est au sein de ce parenchyme cortical qu'on distingue des amas de cellules de petite taille au
contenu densément coloré qui se développent au dépens des tissus parenchymateux corticaux
assimilateurs. Ce sont ces cellules méristématiquès qui sont à l'origine du bourgeon adventif
(PI N° 21 Fig A et B). Leur agencement et le sens des divisions de ces cellules aboutissent à
la formation d'une structure en forme de dôme bordé latéralement par deux masses
méristématiques futurs primordia foliaires. Au dessus de ces cellules on peut observer de
cellules de grande taille qui s'orientent tangentiellement pour former les bords d'un
méristème en émergence.
-
Sur certaines coupes,
à la suite de la prolifération de quelques cellules du
parenchyme fondamental, on distingue des nodules formés directement au sein des tissus du
cortex sans connection vasculaire avec les tissus conducteurs de la racine (pl. N°22 fig A et
A'); ces structures sont de type méristématique avec des cellules denses de petite taille au
rapport nucléoplasmique élevé. Ces structures s'organisent en méristème végétatif avec le
dôme central et les primordia foliaires latéraux
(pl. W22 fig B et B'). Le bourgeon
végétatif se forme en développant un axe de tige et des ébauches de feuilles; on note une
parfaite continuité entre le parenchyme cortical de la racine et celui du bourgeon néoformé.
Cependant, il est intéressant de noter l'absence de connections vasculaires entre le
bourgeon néoformé et le système vasculaire de la racine qui lui a donné naissance. C'est
lorsque le bourgeon est bien developpé qu'il met en place son propre système vasculaire.
3-13) Acclimatation
Les vitroplants issus de culture de racines excisées ont été acclimatés sur un support
fait d'un mélange de perlite et de vermiculite; les explants recouverts d'un film en
polyéthylène se trouvent dans une ambiance saturée en humidité; ils sont régulièrement
arrosés à l'aide d'une solution nutritive de Hoagland et Arnon (1938).
Aprés une phase stationnaire qui dure environ 3 semaines où le vitroplant ne montre aucun
signe de croissance, on observe un ou deux bourgeons situés à la partie terminale de la tige
qui débourrent; la croissance est assez lente mais les explants survivent à la sortie du tube.
Il est apparu que chez A. albida le système racinaire mis en place au cours de la
rhizogénèse "in vitro" n'est pas adéquat; en effet un autre système racinaire s'installe "in
vivo" à la suite de la nécrose des premières racines. Dès que le système racinaire fonctionnel
est bien installé, les vitroplants se développent normalement.

125
3-14)
Discussions
A-· Age et origine des tissus racinaires
Chez A. albida, l'âge de la racine et l'origine du segment racinaire, se sont
révélés influer sur la fréquence et l'intensité organogénétiques.
En effet, on a constaté un gradient décroissant des potentialités de regénération à partir de la
zone proximale vers la zone distale de la racine. La partie proximale est plus différenciée et
contient des tissus plus âgés que la partie distale qui est plus jeune et surtout moins
différenciée.
l:n général les potentialités morphogénétiques décroissent avec l'âge des tissus; ceci
est fréquemment observé au niveau des parties aériennes où les tissus immatures sont les
plus réactifs ; en effet,
plus le tissu est différencié donc déterminé dans son pattern
morphogénétique et plus la réversion de son programme morphogénétique est difficile.
Selon Lazzeri et Dunwell (1984), cette réactivité serait lié à l'activité du péricycle
mieux développé dans les zones proximales de la racines et qui serait à l'origine de la
formation des bourgeons adventifs et des racines adventives. Mais chez A. albida les
bourgeons néoformés n'ont pas une origine péricyclique mais corticale.
D'autre part, les racines d'A. albida âgées de 4 semaines se sont révélées plus
réactives que les racines d'une semaine d'âge. Chez Brassica oleracera, la production de
racines et de pousses adventives augmente lorsque l'âge des semis croît de 6 à 16 jours
(Lazzeri et Dunwell, 1984).
Chez Chondrella juncea (Kefford et Caso, 1972)
le potentiel organogénétique de
racines est croissant jusqu'a 90 jours de culture. Au delà, les racines perdent leurs
potentialités organogènes.
Il apparait ainsi qu'avec l'âge croissant des plantules, et par suite de l'élongation de la racine
principale, on assiste à une augmentation du nombre de sites morphogénétiques capables
d'induire une réponse à la stimulation caulogéne.
Nous avons aussi noté une corrélation positive mais non significative entre le
diamètre des explants racina ires et le taux de caulogénèse chez A. albida ; ce phénomène a été
constaté chez le pommier (Robinson et Swabe , 1977) où l'initiation des bourgeons s'accroît
avec le diamètre de la racine liée à l'activité cambiale; ainsi de nombreux auteurs ont
démontré la nécessité d'avoir une taille seuil qui favorise la regénération "in vitro"
(North,1953 ; Peterson, 1975) .
B- Milieux et conditions de culture

126
Au cours de nos expériences il a été montré que les milieux MS/2 et B5 sont les plus
favorables à une expression optimale de l'organogénèsee "in vitro" à partir de segments
racinaires chez A. albida .
Ces milieux sont caractérisés par leur complexité et par leur plus grande richesse
ionique par rapport aux deux autres milieux utilisés. Les milieux agissent plus sur le
nombre de pousses formées que sur le taux de regénération ; la forte concentration en azote
de ces deux milieux démontre encore une fois le rôle prépondérant de l'azote sur la faculté de
regénération "in vitro" (Lazzeri et Dunwell ,1984).
Chez Dalbergia sisso , le milieu B5 s'est avéré être le meilleur milieu pour la
caulogénèse à partir de segments racinaires. Chez A/locasuarina vertici/lata les exigences
sont différentes car l'espèce réagit mieux à un milieu moins compléxé tel que le milieu BOA
(Alliou~, 1990).
Sur un milieu dépourvu de cytokinine, A. albida est capable de former des bourgeons
adventifs lorsque la composition minérale du milieu de culture n'est pas limitante. Cette
faculté naturelle de produire des pousses feuillées à partir des racines est certainement à
relier à la faculté de l'espèce de drageonner ce qui constitue une des voies naturelles adoptées
par l'espèce en vue de sa propagation dans son habitat.
Généralement les auxines sont considérées comme des hormones qui inhibent la
formation de bourgeons adventifs (Peterson ,1975).
Cependant il a été rapporté (Bonnet et Torrey, 1965 ; Kefford et Caso, 1972) que de faibles
concentrations en auxine peuvent stimuler la caulogénèse "in vitro" alors que de fortes
concentrations l'inhibent.
Concernant les cytokinines utilisées, le 2 iP a permis d'obtenir un nombre optimal de
bourgeons adventifs. Comme pour la BAP, elle n'est active qu'à une concentration trés élevée
proche de 50 pM. La kinétine par contre agit à des concentrations 100 fois plus faibles.
Des
3 substances testées (putrescine (di-amine) ; spermidine( tri-amine) et
spermine (tetra-amine)), il est apparu que les tri et tétra amines (respectivement
spermidine et spermine) sont les plus efficaces pour stimuler la néoformation de bourgeons
sur les explants racinaires d'A. albida.
Ces substances agissent à des doses variant de 10 à 100 pM IL au delà de cette
concentration la réactivité est moindre. Ces polyamines sont des substances naturelles
stimulant la biosynthèse de l'ARN et de l'ADN (Evans et Malmberg, 1989) et qui agissent en
tant qu'inducteurs morphogénétiques pour orienter ou pour accélérer le processus
morphogénétique vers une voie déterminée. Les polyamines sont des substances qu'on associe
généralement à la division cellulaire ( Keves et aL, 1985 ) , et à l'embryogénèse somatique
(Montagüe et aL, 1978; Mengoli et aL, 1989 ; Hadrami et aL,1 989) ; mais chez Medicago

127
sativa, et Hevea braesiliensis, les polyamines ne stimulent pas l'embryogénèse somatique
mais on pense plutôt que
les polyamines sont impliquées dans le processus de re-
programmation des cellules vers une nouvelle voie de morphogénèse "in vitro".
Chez Phaseolus et Vigna (Jarvis et aL,1983 ), le tabac (Torrigiani et aL, 1989), les
polyamines sont responsables de l'initiation et du développement de racines adventives.
Les résultats obtenus chez A. albida confirment le rôle de régulateur de croissance d'un type
nouveau dévolu à ces substances.
La 1-3DPU utilisée à des concentrations croissantes de 1 à 50 pM ne favorise pas une
expression optimale de l'organogénèse des racines d'A. albida . Cependant les composés phenyl
uréidiques sont considérés comme des substances ayant un effet cytokinique trés important
sur une_large gamme d'espèces et en particulier aux espèces qui répondent favorablement
aux cytokinines classiques. Le tidiazuron est une phényl-urée qui stimule la prolifération de
pousses de nombreuses espèces de ligneux du genre Acer et Malus (Mok et aL, 1987).
C- Plasticité et conformité morphogénétigues
La regénération de plantes entiéres à partir racines excisées, de drageons prélevés
sur des arbres adultes et à partir de boutures"in vivo" de racines d'A. albida (Nikiema et
Tolkamp,1992; Danthu, 1992) démontre l'important potentiel de morphogénèse que
possédent les racines de cette espèce.
Les bourgeons émergent et se forment à partir des tissus corticaux chez A. albida . Ce sont
ces cellules situées au niveau du cortex interne, qui, à la suite d'une déchirure des tissus
épidermiques superficiels, laissent apparaître des dômes de cellules méristématiques qui
évoluent plus tard en bourgeons puis en pousses feuillées. Comme chez
de nombreuses
espèces, les bourgeons adventifs ont souvent une origine superficielle épidermique ou sous-
épidermique chez Pinus sylvestris (Jelaska, 1987) et Picea abies (Bornman, 1987) ou au
niveau des assises superficielles du mésophylle chez Pinus pinaster (Jelaska, 1987)
Si on considére que chez A. albida, ce sont les mêmes groupes de cellules qui sont aussi bien
capables de se dé-différencier pour former des structures de racines latérales, de pousses
feuillées et de nodules fixateurs d'azote, on peut souligner l'importance de la plasticité
morphogénétique que présente cette espéce.
Généralement les plants obtenus à partir d'apex ou directement regénérées à partir de
feuilles (Kartha et aL,1977), ne présentent aucune variation; par contre de nombreux
auteurs ont pu montrer qu'une grande variabilité est présente lorsque les plants sont
regénérés à partir de cal (Sibi, 1979; Evans et Sharp, 1983; Sibi,1982; Evans, 1986). Ces
modifications se manifestent au niveau de l'aptitude à l'organogénèse et plus tard, au niveau
des plants différenciés (taux de
croissance, morphologie, production de métabolites,
phyllotaxie, résistance partielle aux maladies etc... ).

128
La durée de la culture "in vitro" et en particulier la longueur de la phase non morphogène est
souvent apparue comme un facteur de variabilité (Demarly et Sibi, 1989). Le nombre de
sub-cultures aussi s'est révélé être
un des principaux facteurs induisant une variabilité
somaclonale (Mc Coy et Philipps, 1982).
Chez A. albida, les bourgeons se forment directement sur les racines sans formation
préalable de cal. Cette absence de cal présente un intérêt évident dans la mesure où les
cellules qui sont à l'origine du bourgeon adventif ne subissent pas de remaniement
chromosomique suceptible d'affecter l'expression du génotype ; ces cellules initales
corticales racinaires n'étant pas initialement destinées à produire des bourgeons, ont soit
subi une dé-différenciation suivie d'une reprogrammation de leur pattern génétique, soit ce
sont d~s cellules ayant gardé un certain degré de totipotence leur conférant une grande
plasticité morphogénétique.
En l'absence des facteurs favorisant la variation somaclonale (organogénèse directe sans
passage par un stade de cal, délai court d'organisation des cellules corticales en méristèmes
caulinaires, absence de phases de sub-cultures), il est légitime de penser que les plants
issus de racines excisées d'A. albida présentent un taux de conformité satisfaisant à une
micropropagation c1onale.
Le taux de multiplication obtenu par voie racina ire, est largement supérieur à
celui obtenu par voie aérienne. Ceci confirme l'extrême réactivité des tissus racina ires (
Chaturvédi et Sin ha, 1979), la vigueur et la rapidité de croissance des pousses qui en sont
issues. Il est dés lors permis d'envisager d'utiliser les tissus racinaires pour explorer les
voies de regénération à partir du matériel végétal adulte qui demeure toujours trés
récalcitrant à de nombreuses méthodes de propagation.
De plus la culture de racines excisées nécessite trés peu de matériel végétal, un fragment de
1,5 cm est capable de générer dans les conditions optimales 8 pousses feuillées; cependant,
comme cela a pu être démontré chez certaines espèces (Keyes et al.,1980), l'impact du
génotype sur la réussite de la culture chez A. albida est un facteur fondamental dont il faut
tenir compte. La possibilité de cultiver aseptiquement et de cloner "in vitro" les racines d'A.
albida (Ahée et Duhoux, 1994), ouvre des perspectives prometteuses dans l'utilisation de
racines excisées sélectionnées en vue de la regénération de plantes entières.

PLANCHE
N° 17
CULTURE DE RACINES EXCISÉES D'A.
albida
Fig.A : Fissuration du rhizoderme dés le Sème jour de culture. (Gr x 20)
Fig.B : A la suite de la culture en présence de lumière, le tissu cortical sousjacent
au rhizoderme est devenu chlorophyllien et développe des ébauches de bourgeons.
Noter la pigmentation rouge des bourgeons révélatrice de la présence de pigments
anthocyaniques. Au bout de 15 jours de culture, on peut noter l'apparition d'un
tissu cortical chlorophillien portant le~ ébauches de bourgeons adventifs (
)( CC
Cellules corticales; Rz : Rhizoderme). (Gr. x 50)
Fig.C: Développement du bourgeon adventif et formation des ébauches foliaires
(Gr. x 50)

c

PLANCHE W 18
Organisation de bourgeons adventifs
sur les fragments de racines
excisées
Les bourgeons se développent soit:
Fig.A : à une extrêmité de la racine, généralement l'extrêmité proximale sans
callogénèse préalable.
(Gr. x 10)
Fig.B : sur toute la longueur de la racine; noter sur cette photo l'apparition d'un
bourgeon adventif à l'aisselle d'une racine latérale (Gr. x 20)
Fig.C : Sur certains individus, en présence de Spermidine (10-6 M) la racine
développe une masse de cal abondante à partir de laquelle émergent des bourgeons
adventifs (Gr. x 25).'

®
A
B
c

PLANCHE W
19
Organogénèse des bourgeons à partir de tissus racinaires
d'A.
albida
Fig.A : La formation des bourgeons est un phénomène progressif qui s'effectue en 5
stades évolutifs:
1) protubérance non encore chlorophyllienne non encore organisée
2) protubérance dont quelques cellules centrales se chargent en
chlorophylle
3) Protubérance entièrement constituée de tissus chlorophylliens
4) bourgeons adventifs
5) tigelle issue de l'élongation du bourgeon adventif
(Gr. x 20)
Fig.B: Elongation du bourgeon adventif qui se développe en s'accroissant et en
formant de nouvelles ébauches foliaires(Gr. x 25)
Fig.C: Certains explants sont trés cau!ogénes, il n'est pas rare d'observer des
fragments de racines formant 8 à 10 bourgeons en une seule culture (Gr. x 20).

A
B
c

Planche
W20
Développement des bourgeons issus de culture de racines excisées
Fig.A: Bourgeon allongé en pousse feuillée trés vigoureuse. Noter le développement
concommitant des racines latérales qui s'allongent dans le milieu de culture
(Gr. x 10)
Fig.B: Enracinement d'une pousse feuillée issue de bourgeon adventif sur un
milieu contenant de l'AIB (0,1 mg/I) (Gr. x 10).

A

PLANCHE
W21
Histologie des bourgeons adventifs
Fig. A : Coupe transversale au niveau d'une protubérance chlorophyllienne;
l'origine des bourgeons est corticale superficielle. (Pc: parenchyme cortical)
(Gr. x 250)
Fig.B: Vue détaillée de la protubérance; noter la présence d'une assise
procambiale( ) qui limite les cellules du parenchyme fondamental en division.
(Pc: parenchyme cortical)
(Gr. x 400).

B

PLANCHE N° 22
Histologie des nodules méristématiques initiateurs des bourgeons
adventifs à partir de tissus racinaires d'A.
albida
Fig.A-A' : Au sein du tissu parenchymateux cortical externe, s'individualisent
deux amas de cellules densément colorées à rapport nucléoplasmique élevé formant
des nodules méristématiques( N.m.). Ces deux amas sont les premières ébauches
du futur méristème organogéne (
). (Fig A : Gr. x 50; Fig A' : Gr. x 125)
Fig.8-8': Ces nodules évoluent en bourgeon; on distingue la zone axiale (Z.a.)
constituée de petites cellules méristématiques et un primordium foliaire(p. f.)
bien différencié. (Fig 8 : Gr. x 125; fig 8' :Gr. x 250)

A
8
~L.

SYMBIOSE FIXATRICE
D'AZOTE

Tab!. N° 2 : composition minérale et organique des substrats utilisées
pH
C (ppm)
N (ppm)
C/N
: ,~.
SN
8,35
3,91
0,47
8,30,
CM
8,43
2,31
0,29
7,97
Phosphate
Phosp
Ca
Mg
Na
K
somme
V
total ppm
assim ppm
meq!100 g meq!100 g
meq!100 g meq!100 g
meq!100 g
SN
0,871
225,4
2,82
2,43
0,181
0,39
5,82
5,57
CM
0,521
151,8
2,08
1,79
0,316
0,424
4,61
4,1

130
D) ETUDE DE LA SYMBIOSE FIXATRICE D'AZOTE ATMOSPHÉRIQUE
1) INFLUENCE
DU
SUBSTRAT DE
CULTURE
Le test effectué a porté sur l'étude du substrat; 2 types de substrat ont été utilisés: un
substrat siliceux pauvre en éléments nutritifs et un substrat riche en matières humiques
et en éléments minéraux.
Al Croissance et morphogénèse
Le substrat SN riche en éléments nutritifs (tabl. N°Sa), favorise la croissance de la partie
aériennne aussi bien chez les plants inoculés que chez les plants non inoculés. Les valeurs de
croissance obtenues entre plants inoculés et non inoculés ne sont pas significativement
différentes; l'effet-de l'inoculation semble ici négligeable, c'est plutôt la nature du subst~at
qui joue le rôle prépondérant.
Sur le substrat SN, il se développe un chevelu racinaire trés important qui en se déployant,
colonise la quasi totalité du substrat; dans ces conditions le pivot est généralement court, de
nombreuses racines latérales sont formées ; les ramifications augmentant, le chevelu
racinaire devient trés dense.
Par contre sur le substrat siliceux CM, le pivot est généralement beaucoup plus long, il se
développe peu de racines secondaires et par conséquent, le chevelu racinaire est beaucoup
moins dense.
Bl Nodulation
Il est apparu au cours de cette expenence que le substrat siliceux pauvre en matière
organique favorise la nodulation. Dans ces conditions, les nodules formés sont gros,
multilobés et s'installent soit au niveau du collet soit sur les ramifications latérales. La
comparaison des moyennes par le Test de Fischer, permet de déceler des differences
significatives au seuil de S% entre les deux traitements du point de vue nodulation.
Cependant, cette bonne nodulation n'est pas positivement corrélée avec une bonne croissance
des parties aériennes.
Cl Teneur en éléments nutritifs du substrat
En considérant la dynamique des éléments nutritifs du substrat, une analyse aux
temps TO avant l'inoculation et Tf aprés deux mois de culture (tabl. N°S9), au moment où les
plants ont été sacrifiés, on note une difference d'évolution des teneurs en éléments nutritifs
dans les deux traitements.

Tabl. N° 58 :Influence de la nature du substrat sur la croissance et la nodulation de plants d'A. albida au
bout de 2 mois
SN : Sable noir riche en éléments' minéraux et organiques
CM : Sable blanc pauvre en éléments minéraux et orfaniques
Long Partie Aér (cm)
Long Partie Rac (cm)
Nombre nodules
Inoculés SN
18,66 a
12,37 b
10,5 b
Inoculés CM
12,12 b
17,75 a
16,87a
non Inoculés SN
15,66 a
9,32 b
non Inoculés CM
11,5 b
11,5 b
Tabl. N° 59 :Evolution des valeurs des differents paramétres physico-chimiques des deux substrats
utilisés (CM et SN) en début de culture (T initial) et en fin de culture (T final)
r parametre
traitement
T initial
T final
Variation
SN
8,3
8,4
pH
CM
8,43
8,51
SN
3,91
4,26
+8,90%
C (meq)
CM
2,31
1,76
-2,90%
SN
0,47
0,4
N (meq)
CM
0,29
0,21
-27%
SN
8,3
10,65
+ 28%
C/N
CM
7,97
9,26
+16,10%
SN
0,871
0,828
P (meq)
CM
0,521
0,324
-37,80%
SN
225,4
285,2
+26%
Passim
CM
151,8
78,2
-48%
(meq)
SN
2,82
3,07
+9,50%
Ca (meq)
CM
2,08
1,58
-24,50%
SN
0,181
0,304
+67,90%
Na (meq)
CM
0,316
0,325
+ 2,8%
SN
0,39
0,67
+71,70%
K (meq)
CM
0,424
0,22
-48,10%
SN
5,82
8,2
+ 40,8%
S (meq)
CM
4,61
3,37
-26,80%

131
Sur un substrat squelettique et pauvre, on peut observer une tendance régressive vers un
épuisement rapide du sol car les prélevements en éléments nutritifs de la plante en réduisent
de façon sensible la teneur en particulier en N, P assimilable, K et Ca.
Par contre, sur un substrat riche en éléments nutritifs, la tendance est vers la stabilisation
et
l'enrichissement des éléments minéraux; les capacités d'échanges ioniques sont
améliorées avec des augmentations de 26% en Phosphore assimilable, 71,7% en Potassium
et 67,9% en Sodium et 9,5% en Calcium.
Aucune tendance régressive dans la teneur en éléments nutritifs n'est constatée.
D)Discussions
La nature du substrat agit sur la nodulation
et sur l'architecture de la plante.
Lorsque les conditions sont limitantes (sol pauvre en éléments nutritifs), la plante
développe un pivot puissant, allongé avec trés peu de racines latérales. A l'inverse, face à des
conditions de sol enrichi, l'architecture de la plante se modifie pour développer à la place
d'un pivot long, un système plus court plus ramifié et présentant un chevelu racinaire plus
dense
qui arrive à coloniser la totalité du substrat et mobiliser ainsi tous les éléments
nutritifs disponibles dans le sol. Ceci est lié principalement à l'effet de l'environnement
immédiat racinaire notamment ,la présence de P assimilable d'N, K et S qui favorise le
développement de la plante entière en maintenant un équilibre adéquat tout en évitant les
pertes.
Il est apparu que le développement de la plante au cours de ces deux mois de culture, est
tributaire de la disponibilité et des apports en éléments nutritifs du sol. Dans ces conditions,
l'inoculation n'a pas d'effet sur la croissance des plants. Les différences non significatives
entre les témoins non inoculés et les plants inoculés cultivés tous deux sur un substat riche
en éléments nutritifs, montrent que lorsque les éléments nutritifs sont disponibles en
quantité suffisante, la plante choisit la voie de l'assimilation plutôt que la voie de la
symbiose.
En effet, la présence d'un système racinaire
abondant colonisant la totalité du substrat
associée à une assimilation efficace des éléments nutritifs, permettent d'obtenir un
rendement élevé de la transformation en biomasse (Danso et aL, 1991).
D'autre part, comme l'ont montré Sougoufara et aL, (1989) l'aptitude à fixer l'azote et
l'aptitude à assimiler l'azote provenant du sol constituent deux modalités de prélevement de
l'azote totalement indépendants l'un de l'a~tre. La teneur du sol en éléments nutritifs
constitue le principal facteur orientant le métabolisme azoté vers une assimilation racinaire
ou vers une symbiose.

132
Chez les légumineuses en général, l'assimilation de i'azote soit directement à partir du sol
ou bien à partir des produits de la symbiose fixatrice d'azote dépend de la disponibilité du sol
en nitrate et en ammonium et des conditions de l'environnement (pH, Température, etc ...).
Chez A. albida il a été établi (Sanginga et aL, ;];990) que seule une faible proportion de
l'azote (20% de l'azote total) provient de la fixatidn et par conséquent l'espèce se développe
en privilégiant la voie de l'assimilation des réserves azotées du sol.
Marrioti et aL, 1992, surCasuarina équisetifolia a fait la même déduction à partir de
l'estimation de l'azote fixé en présence d'azote combiné dans le sol; il semble que Casuarina
comme la plupart des espèces fixatrices d'azote préfère utiliser l'azote combiné du sol
10rsqu'iJ est disponible plutôt que de recourir à l'azote issu de la symbiose.
Par contre chez Leucaena leucocephala une importante proportion 52 à 64% de l'azote est
issu de la fixation lorsque la souche utilisée est effective (Sanginga et al., 1985).
On sait aussi que les nodules sont de grands consommateurs d'énergie (Salsac
et aL, 1984); l'effet dépressif constaté de la nodulation sur les paramètres de croissance,
serait dû au détournement d'une grande partie des métabolites vers les racines et les nodules
au détriment des parties aériennes.
Sur un substrat squelettique et pauvre, on avons pu observer une tendance régressive vers
un épuisement rapide du sol liés aux prélevements en éléments nutritifs de la plante. Par
contre, sur un substrat riche en éléments nutritifs, nous avons constaté qu'entre le temps
TO initial et le temps Tf Final, le sol a pu accumuler des éléments minéraux révélant un
enrichissement avec une amélioration des capacités d'échanges ioniques.
Ce phénomène d'enrichissement du substrat que nous avons constaté, trouve une
explication dans le fait qu'en présence d'une activité microbiologique plus intense dans le sol
riche en éléments nutritifs (Charreau et Vidal, 1965), la décomposition et le recyclage des
racines fines induisent une restitution rapide au sol des éléments minéraux.
Ces constations renforcent l'hypothèse déja émise par Brouwer et aL, 1992 sur la pré-
existence des micro-sites favorables à l'installation et au développement d'A. albida. En effet
Brouwer et al., (1992) suggérent que l'''effet albida" se caractérisant par une augmentation
des rendements à l'approche de la canopée ne serait pas totalement liée à l'arbre mais plutôt
au fait que l'arbre choisit et s'implante préférentiellement sur des micro-sites favorables.
Ces micro-sites qui sont d'anciennes termitières sont des zones trés riches en matière
organique et éléments minéraux
qui participent activement à la croissance et au
développement des plants d'A. albida.

133
2)INFLUENCE DE L'INOCULATION AVEC DIFFERENTES SOUCHES DE RHIZOBIUM
2 - 1) Expérience menée en serre
Plusieurs souches de Bradyrhizobium 47.6.4 , 45.6.1 et 47.6.3 (isolées sur A.
albida) et
BAYE IR (isolées sur A. mangium) ont été comparées avec des souches de
Rhizobium à croissance rapide Pj 12 (isolée sur Prosopis juliflora) et Tai 1405 (isolée sur
Leucaena leucocephala).
Aprés 14 semaines de culture, les paramètres de hauteur de poids sec des parties aériennes
poids sec des parties racinaires ARA, SARA, Azote total ont été mesurés.
Le nombre de nodules n'a pas été mesuré car selon de nombreux auteurs, la biomasse
nodulaire en particulier le poids sec des nodules est un critère plus fiable pour estimer
l'intensité de la nodulation (Sougoufara et al., 1989 ).
A) Croissance et biomasse
On constate un effet positif de l'inoculation car en l'absence de tout apport azoté, les
plants témoins non inoculés présentent une mauvaise croissance aussi bien des parties
aériennes que des parties racinaires. L'aspect végétatif dénote une carence en azote avec des
feuilles petites et chlorosées. Les plants inoculés avec les différentes souches sont d'aspect
vert et présentent une croissance vigoureuse.
L'inoculation avec la souche Baye IR améliore sensiblement la croissance en hauteur;
le gain de croissance est estimé à 58% par rapport au témoin non inoculé (fig N° 30).
En considérant la biomasse des parties aériennes (fig N° 31), on constate que la
souche Baye IR est la plus performante puisqu'en sa présence, le poids sec des parties
aériennes est le plus élevé. Cette souche est suivie dans le classement par les souches
natives d'A. albida ; les souches à croissance rapide sont les moins performantes.
Lorsqu'on considère la biomasse racinaire (fig N° 32), la souche Baye IR reste la plus
performante avec un poids sec moyen des racines significativement différent de ceux obtenus
en présence des autres souches; les souches natives sont intermédiaires alors que les plus
faibles valeurs sont observées avec la souche de Rhizobium à croissance rapide Tai 1405.
Néanmoins la souche Pj 12 présente des performances moyennes.
Le poids sec des nodules est élevé pour la souche Pjl 2 à croissance rapide (fig 33); les
nodules sont nombreux et de tres petite taille; par contre, les souches de Bradyrhizobium à
croissance lente (Baye IR et 47.6.4)produisent peu de nodules mais les nodules formés sont
gros et multilobés.
B) ARA et SARA

Fig N°30: Hauteur totale de plants d'A. albida inoculés en serre avec 2 souches de Rhizobium (marquées
par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium aprés 15 semaines de culture en pots
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Fig N°31 : Poids sec des parties aériennes de plants d'A. albida inoculés en serre avec 2 souches de
Rhizobium (marquées par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium apérs 15 semaines de culture en
pots
250 -
a
b
200 -
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c
Souches

Fig N°32 : Poids sec des parties racinaires de plants d'A. albida inoculés en serre avec 2 souches de
Rhizobium (marquées par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium aprés 15 semaines de culture en
pots
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Souches
Fig N°33 : Poids sec des nodules de plants d'A. albida inoculés en serre avec 2 souches de Rhizobium
(marquées par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium aprés 15 semaines de culture en pots
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souches

Fig N°34: Activité réductrice d'acétylène (A~) de plantsd'A.albida inoculés en serre avec 2 souches de
Rhizobium (marquées par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium aprés 15 semaines de culture en
pots
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souches
Fig N°35 : Activité réductrice d'acétylène spécifique (SARA) de plants d'A. albida inoculés en serre avec
2 souches de Rhizobium (marquées par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium aprés 15 semaines
de culture en pots
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Fig U'36 : ./l.zote tûtal des plarlt3 dIA. 'iJ~'1id'l inoculés ensel1'e B5lec 2 souches de Rhi2obiu:m (m.arquées par
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134
L'activité réductrice d'Acétylène qui permet une estimation instantanée de la quantité d'azote
fixée par unité de temps et par plant, fournit des indications fiables lorsqu'on cherche à
comparer l'efficience de différentes souches. Sur la figure N°34 les souches sont classées
par ordre décroissant de l'activité nitrogénasique; les souches de Bradyrhizobium
se
trouvent en tête de classement alors que les souches de Rhizobium à croissance rapide ont des
valeurs d'ARA plus faibles.
LI ARA spécifique ou SARA est, pour une plante ou une souche donnée,
une valeur d'Activité Réductrice d'Acetylène rapportée au poids sec des nodules formés; il
donne une indication de l'efficience nodulaire; d'après les valeurs de SARA (fig W 35), on
constate que les nodules formés à partir de la symbiose avec les souches natives ont une
efficience plus marquée que les nodules formés en présence des souches non natives (Baye
IR) et des souches de Rhizobium à croissance rapide (Pj12 et TAL 1405).
C) Azote total de la plante
La méthode d'estimation de l'azote fixé par la difference d'azote total entre plants inoculés et
plants témoins non inoculés dans des conditions de sol dépourvu d'azote constitue une bonne
méthode de quantification de l'azote fixé (fig N° 36) et (tabI.N°60). La souche BAYE IR fixe
une quantité d'azote significativement plus importante par rapport aux autres souches (4,96
mg d'azote par plant); la souche 47.6.4 est parmi les souches natives d'A. albida la plus
efficiente (2,95 mg d'azote par plant); les autres souches ne présentent pas de difference
significative entre elles.
D) Corrélation entre les differents paramètres étudiés
L'étude de la matrice de corrélation des variables mesurées (tabl. W61 )montre que l'azote
total est un critère corrélé de manière significative à la hauteur (0,934) au poids sec des
parties aériennes (0,958) et au poids sec des parties racinaires( 0,844). Par conséquent,
les paramètres de biomasse sont des paramètres discriminants à prendre en compte lors de
l'estimation de ('efficience de la symbiose.
D'autre part, il existe une bonne corrélation positive entre la biomasse des parties aériennes
et la biomasse des parties racinaires ; ainsi la souche qui améliore la croissance des parties
aériennes améliore en même temps le développement du système racinaire.
Par contre, il n'existe aucune corrélation significative entre les paramètres de croissance,
de biomasse, d'azote total et les paramètres d'activité nitrogénasique (ARA et SARA).
2-2) Etude de l'effectivité des souches en tube de culture

Tabl. N"60: Effet de l'inoculation de plants d'A. albida inoculés en serre avec 2 souches de Rhizobium
(marquées par astérisques) et 4 souches de Bradyrhizobium sur la quantité d'azote total et d'azote fixé
(évaluée d'aprés la méthode pardifference) aprés 1S semaines de culture en serre
traitements
Tai
1405*
47.6.3
45.6.1
BAYE IR
47.6.4
Pj12*
Témoin NI
Azote total/plant ( mg)
5,17
4,98
4,29
7,8
6,02
5,09
3,07
Azote fixé/ plant (mg)
2,1
1,91
1,22
4,73
2,95
2,02
o
Tabl. N° 61 : Matrice de corrélation des paramétres mesurés sur les plants d'A. albida inoculés en serre
avec 2 so~ches de Rhizobium et 4 souches de Bradyrhizobium aprés 1S semaines de culture en pots
Matrice de corrélation pour les variables : X,... X7
HT
PSPA
PSPR
ARA
SARA
P sec nad N total
HT
1
PSPA
,859
1
PSPR
,753
,927
1
ARA
,585
,478
,351
1
SARA
,374
,426
,145
,79
1
P sec nad
,261
-,087
,044
,414
-,085
1
N total
,934
,958
,864
,404
,315
-,044
1
*Ht= hauteur totale (cm)
*PSPA = Poids sec des parties aériennes (mg)
*PS PA = Poids sec des parties racinaires
*P sec nod= Poids sec des nodules (mg)
*ARA = Activité réductrice d'Acétylène (nM/h/plant)
*SARA= Activité réductrice d'Acétylène spécifique (nM/h/mg de nodule sec)
*N total = azote PA+Azote PR +Azote nod (mg)

135
L'inoculation des jeunes plantules diA. albida a été effectuée avec différentes souches
de Rhizobium (47.6.4, Baye IR et PJ 12) (Tab!. N°62); ces trois souches sont identifiées
comme trés differentes du point de vue de leurs origines respectives, et ont déja montré des
différences tres nettes dans la réponse à l'inoculation en serre.
A) Efficience des souches
L'analyse de variance du caractère hauteur totale de la partie aérienne révèle des
différences significatives entre les traitements. Le traitement témoin en l'absence de toute
inoculation et de toute contamination se différencie des autres traitements; l'analyse de
critères de hauteur totale, poids sec des nodules et quantité d'azote totale montre une nette
supérior!té de la souche de Bradyrhizobium native 47.6.4 isolée sur A. albida.
Lorsqu'on considère le poids sec des parties aériennes et racinaires la souche Baye IR
souche de Bradyrhizobium isolée sur A. mangium, se comporte aussi bien que la souche
native 47.6.4.
L'azote total dosé par méthode Kjehdal révèle une plus forte accumulation d'azote dans
les tissus en présence de la souche native. Il est ainsi démontré que si la souche Baye Ir est
aussi infective que la souche native, l'exploitation du potentiel de fixation est optimisée en
présence de la souche 47.6.4.
Comme cela a été démontré auparavant sur les plantes inoculées en serre, A. albida est nodulé
ausi bien par les souches de Rhizobium à croissance rapide que par les souches de Rhizobium
à croissance lente (Bradyrhizobium); l'efficience de la fixation est optimisée en présence de
Bradyrhizobium, et en particulier lorsqu'on utilise une souche native. Les performances "in
vitro sont plus faibles par rapport à celles observées en serre; en effet les valeurs obtenues
en serre sont 2 à 3 fois plus élevées que celles obtenues en tubes pour une durée de culture
plus courte.
B) Dynamique de la nodulation par les differentes souches en tube
Les plants cultivés en tubes ont été suivis pendant 30 jours et le nombre de nodules formés a
été noté jour aprés jour. Pour des raisons de commodité il a été défini 3 périodes à partir de
la 3ème semaine (date où les premiers nodules apparaissent "in vitro") ; ces périodes vont
de la 3ème à 4ème semaine puis de la 4ème à la 6ème semaine enfin de 6ème à la 8ème
semaine à partir de la date de l'inoculation (fig W 37).
- la souche BAYE IR est tres infective, l'intensité maximale d'infectivité est obtenue
au bout de la première semaine où un nombre maximal de nodules est formé; l'infectivité
chute progressivement à 15 et 30 jours
- la souche 47.6.4 souche de Bradyrhizobium native d'A. albida répond à l'inoculation
par une courbe d'infectivité ascendante qui suit la croissance du système racinaire

SYMBIOSE FIXATRICE D'AZOTE CHEZ A. albida
Planche N° 23
Inoculation en tube
de jeunes plants d'Acacia albida
Fig. A : Inoculation dans les tubes de culture de plants d'A. albida ayant subi
une' excision de l'apex de racine et cultivé sur motte Milcap. Les nodules se
forment sur les racines latérales C-') .(Gr. x 2,5)

®
A

Tabl N° 62: Influence de la nature de la souche sur la croissance, la biomasse et la quantité totale d'azote
par plant chez A. albida inoculé avec 2 souches de Bradyrhizobium et une souche de Rhizobium (marquée
par astérisques) aprés 3 mois de culture "in vitro"
souches
hauteur totale
Poids Sec
Poids Sec Partie
Poids Sec Partie
cm
nodules m
aerienne m
racinaire
m
BAYE IR
13b
3,2 b
100,8 a
17,5 a
PJ 12 *
13 b
3,5 b
76,3 b
20 a
3,63 b
47.6.4
15,2 a
4,12 a
116,6 a
22,9 a
5,85 a
T non Inoculé
8,4
c
0
64,9 b
17,5 a
2,7 b
Tabl N° 63: Influence de la date d'inoculation avec la souche 47.6.4 sur la croissance la biomasse et sur la
quantité d'azote total par plant chez A. albida aprés 3 mois de culture "in vitro"
DATE INOCUL
hauteur totale
Poids Sec
Poids Sec Partie
Poids Sec Partie
cm
nodules m
aerienne
m
racinaire m
o J
14,8 a
5,8 a
89,2 a
24,1 a
10 J
15 a
5,11 a
78,3 a
12,8 b
3,18 a
20 J
10,08 b
0
70,8 a
11,9 b
2,3 a

136
- la souche Pj 12 de Rhizobium à croissance rapide produit peu de nodules avec A.
albida au cours de la première semaine et leur nombre reste stationnaire et faible.
2-3) Influence de la date de l'inoculation
Nous avons cherché à déterminer la date optimale pour une bonne réponse à
l'inoculation. 3 périodes d'inoculation ont été choisies: 0 jour, 10 jours et 20 jours aprés
la germination. L'inoculation a été faite avec la souche 47.6.4 dans des tubes de culture.
L'analyse des résultats (tabl.63) montre que les plants inoculés entre 0 et 10 jours se
développent mieux que les plants inoculés à 20 jours; en effet l'inoculation effectuée au
moment de la mise en culture favorise une bonne croissance des parties aériennes et
racinaires ; les critères de poids sec des nodules et d'azote total par plant ne se différencient
pas pour les deux traitements 0 jours et 1 jours.
Par contre, lorsque l'inoculation est effectuée aprés 20 jours la nodulation est presque
absente, la croissance des plants est ralentie, les plantules jaunissent et présentent un
aspect rabougri.
En suivant la cinétique de formation des nodules on constate que (fig N° 38):
- l'inoculation à 0 jour produit des nodules nombreux, l'expression de
l'infectivité est maximale durant la première semaine; le nombre de nodules décroît durant
les semaines suivantes.
- Par contre lorsque l'inoculation est effectuée 10 jours aprés la germination, la
formation des nodules est continue et croissante. L'inoculation à 10 jours est la période
optimale pour obtenir un grand nombre de nodules "in vitro". L'infectivité est trés
importante, lors des 15 premiers jours (10 nodules en moyenne sont formés par semaine);
cette expression de l'infectivité s'accroît lors des deux semaines suivantes.
2-4) Discussion
A) Spécificité de l'association Rhizobium (s.1.) / Acacia albida
Cette expérience de criblage de souches vient confirmer les constatations établissant
que A. albida nodule aussi bien en présence des souches de Rhizobium à croissance rapide
qu'avec les souches à croissance lente, Bradyrhizobium (Galiana et al., 1990; Gueye, 1992).
A albida est une espèce trés peu spécifique (promiscuous) puisque l'espèce nodule et fixe
l'azote indifféremment avec des souches de Rhizobium PJ 12 et TAL 1405 ; cependant, il faut
remarquer la petite taille des nodules et leur grand nombre en présence de souches de
Rhizobium s.s.. Par contre lorsque l'inoculation est effectuée avec des souches de

Fig N"38: Cinétique de la formation des ItOdules en tubes au coms de 5 serr.L8ines sui1lant l'irtOculatiün; les plailts ont
été ITlOC1Jlés "in vitro" a1i"ec la souche 47.6..:1 à0 JOUI. 10 j01)IS et 20 jouIS aprés la mise en place des p1.3nt3 en tube
(TO).
"
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10

137
Bradyrhizobium, les nodules formés sont gros, de forme sphérique ou ellypsoidale et
surtout, moins nombreux.
Nous avons aisi montré au cours de cette expérience que l'espèce A. albida est aussi bien
nodulé par des souches de Bradyrhizobium que par des souches de Rhizobium mais
l'association avec les souches de Bradyrizobium est la plus efficiente.
Cette absence de spécificité dans la nodulation en fait une espèce à faible potentiel fixateur
(Dommergues, 1987) comme la plupart des espèces sahéliennes d'Acacia bien adaptées au
climat aride. Cette non spécificité ("promiscuous") et l'ubiquité des souches nodulant A.
albida constitue un avantage puisque l'inoculation n'est pas toujours nécessaire, en revanche,
la réponse à l'inoculation est peu spectaculaire et à la limite elle est souvent insignifiante;
par con.tre Leucaena leucocephala qui est une espèce trés spécifique dans ses association
symbiotiques, ne peut noduler et fixer l'azote de manière efficace qu'en présence de la souche
adéquate de Rhizobium à croissance rapide (Sanginga et aL, 1988). Acacia mangium est aussi
une espèce trés spécifique qui ne forme des nodules effectifs qu'en présence de certaines
souches de Bradyrhizobium sp. (Galiana 1990). Par contre Acacia auriculiformis tout
comme Arachis hypogeae , est classée dans le groupe "promiscuous and effective" puiqu'elle
nodule de manière effective avec un grand nombre de souches.
Malgré cette absence de spécificité chez A. albida, on a montré que la réponse à
l'inoculation est trés variable en fonction des souches. La variabilité dans l'effectivité des
souches de Bradyrhizobium a été démontré chez Acacia mangium (Galiana et aL, 1990).
Il apparait au vu de nos résultats, que l'optimisation de la quantité d'azote fixée ne pourra
être réalisée que lorsque les souches les plus efficientes sont utilisées pour l'inoculation. En
effet, chez Acacia albida, l'efficience dans la symbiose fixatrice d'azote est accrûe lorsque les
souches les plus efficientes sont utilisées en particulier la souche Baye IR et la souche native
47.6.4. Ainsi la nécessité de sélectionner les souches les plus performantes s'affirme de plus
en plus afin d'améliorer le potentiel fixateur.
Les expériences menées aussi bien en serre qu'en tubes ont montré une similarité de réponse
dans les deux conditions de culture. Les souches les plus performantes en serre (47.6.4 et
Baye IR) se sont avérées être les meilleures en tube.
L'absence de spécificité d'A. albida vis-à-vis des souches à croissance rapide et des souches à
croissance lente se retrouve sur les résultats en tubes.
D'autre part, en examinant la dynamique d'infection des racines par les différentes souches,
on remarque que les souches ont des stratégies d'infection qui varient; la souche BAYE IR est
trés infective si on considère la rapidité avec laquelle elle infecte la plante alors que la
souche 47.6.4 a une infection progressive dans le temps.

138
Cela suppose une mobilité plus grande et/ou
un mécanisme de reconnaissance entre la
bactérie et la cellule de la plante-hôte plus performant chez la souche Baye Ir que chez la
souche 47.6.4.
Cependant, la diminutiàn du nombre de nodules formés au cours des semaines
suivantes à la suite de l'inoculation avec la souche Baye IR, révèlerait un disfonctionnement
de la symbiose fixatrice d'azote résultant de la non adéquation de la souche, phénomène que la
plante aura tendance à réduire en limitant et en inhibant la formation ultérieure des nodules.
Il est aussi probable que la plante par un mécanisme de régulation diminue le nombre de
nodules formés pour permettre aux nodules déja formés de se développer comme cela a été
montré chez A. mangium (Galiana et al., 1990).
Inversement lorsqu'il s'agit de la souche native moins rapide, la reconnaissance prend place
plus tardivement, mais la formation ultérieure des nodules n'est pas inhibée.
Cette aptitude à noduler en présence de souches de Rhizobium et de Bradyrhizobium démontre
parfaitement que les deux phénoménes reconnaissance et activité symbiotique fixatrice
d'azote sont deux phénomènes distincts. L'absence de spécificité pose le problème de la
reconnaissance entre plante et bactérie qui se situerait à trois niveaux:
l'absence de
spécificité pourrait être liée soit à des mutations au niveau des génes Nod spécifiques
responsables de la spécificité du spectre d'hôte soit à l'émission de nombreuses molécules
(flavonoides)
par la plante-hote qui seraient reconnues par un grand nombre de micro-
organismes, soit à l'éxistence d'une grande variabilité au niveau des sites moléculaires de
reconnaissance et d'attachement (probablement les lectines). Les études moléculaires sur
les génes induisant des signaux extra-cellulaires entre la bactérie et la plante et des signaux
intra-cellulaires, ont permis d'identifier quelques génes NOD responsables de la spécificité
dans la reconnaissance. Chez certaines lignées de soja le géne nolA est le gene responsable de
la spécificité de la reconnaissance entre la lignée de soja et une souche de Rhizobium. La
plupart des souches de R. léguminosarum qui nodulent les pois européens ne nodulent pas le.
pois d'Afghanistan. Un seul géne localisé au niveau de la plante régule cette reconnaissance
restrictive (Lie 1974). Il existe une souche de R. leguminosarum qui est capable de
surmonter cette restriction et de noduler effectivement avec les pois d'Afghanistan. Cette
souche posséde un seul géne le géne nodX qui est supposé modifier les facteurs Nod pour qu'ils
soient reconnus par la plante.
En utilisant la voie de la transformation génétique et l'intégration de nouveaux génes, des
auteurs ont pu montrer que les lectines racinaires sont des facteurs déterminants dans la
reconnaissance spécifique entre Légumineuses et Rhizobium. En effet, en raison de
nombreuses similarités structurales avec les facteurs NOD, en particulier les hexosamine-
oligosaccharides (Lis et Sharon, 1986), les lectines abondants au niveau de l'apex racinaire
pourraient constituer une partie intégrante du complexe signal facteur NOD/ récepteur
(Lugtenberg et al., 1991).

139
B) Activité fixatrice d'azote
Les témoins non inoculés n'ont pas subi de contamination. Aucun d'eux n'a nodulé; le substrat
étant arrosé avec une solution nutritive de Jensen dépourvue d'azote, tout l'azote dosé au
niveau de la plante entière provient du métabolisme à partir des réserves cotylédonnaires.
En l'absence de toute interférence liée à l'âge des plantes et au recyclage des racines fines
mortes (l'expérience a été arrétée au bout de 14 semaines), l'azote total des plants témoins
non inoculés constitue une valeur fiable à partir de laquelle on peut valablement déduire la
quantité d'azote apportée par la symbiose (Danso et al., 1991).
Sanginga et al.,( 1990) en utilisant des plants d'A. albida inoculés, avait constaté que l'effet
de l'inoculation n'était décelable qu'à partir de 24 et 36 semaines de culture. Au cours de
notre expérience, nous avons montré que sur un substrat synthétique (perlite et
vermiculite) arrosé avec une solution nutritive sans azote, il est possible d'observer une
réponse suffisamment nette à l'inoculation chez A. albida avant la 14ème semaine de culture.
Au cours des premiers stades de developpement, la performance au point de vue fixation
d'azote estimée en terme de la quantité d'azote fixée, est directement reliée à la productivité
en biomasse végétale chez A. albida; en effet les performances observées (croissance,
biomasse aérienne et racinaire) qui sont nettement plus importantes en présence de la
souche Baye IR, bien qu'elles ne soient pas significativement corrélées avec l'activité
nitrogénasique constatée au niveau des nodules, sont bien corrélées avec l'azote total. Comme
chez Casuarina equisetifolia (Sougoufara et al., 1989), où les critères de sélection à
privilégier sont la biomasse aérienne racinaire et nodulaire, nous avons montré que chez A.
albida, les critères de biomasse aérienne et racina ire, qui sont des paramètres simples à
déterminer et reflètent bien l'efficience de la symbiose fixatrice d'azote.
En présence d'une bonne corrélation positive (0,927) entre la biomasse aérienne et la
biomasse racinaire, la souche qui améliore la biomasse aérienne améliore en même temps la
biomasse racinaire; en définitive le paramètre poids sec des parties aériennes donne une
bonne indication de l'efficience de la symbiose.
C) influence de la date de l'inoculation sur la nodulation
Une inoculation effectuée entre 0 et 10 jours est plus favorable à la
nodulation ; il apparait en effet qu'à cette période la plupart des organes sont en formation,
les racines principales commencent à former des ramifications secondaires; la présence de
racines secondaires favoriserait l'initiation de poils absorbants jeunes qui constituent les
sites privilégiés d'infection par la bactérie (Nutman,1956). Au bout de 20 jours de culture
sur milieu axénique, l'inoculation à cette période ne produit aucun nodule bien que les
ramifications secondaires soient en place. Il est probable que des modifications de la

140
composition du milieu de culture notammant le pH, la faible mobilité des bactéries, les
modifications structurales des parois des cellules des poils entraineraient une absence de
nodulation.
Comme cela a été démontré chez A. mangium (Galiana et al., 1990), lorsque l'inoculation
survient entre 0 et 15 jours, on obtient une nodulation abondante; les nodules se forment en
particulier au niveau du collet; par contre lorsque l'inoculation est retardée à 30 et 45
jours, la réponse à la nodulation est beaucoup plus réduite et par conséquent la fixation est
moins bonne. L'étude de la cinétique de la nodulation chez Acacia mangium avait mis en
évidence l'existence de deux pics de nodulation le premier entre 15 et 30 jours, le second à
partir du GOème jour; ces deux pics de nodulation sont séparés d'une phase -plateau, période
au cours de laquelle les nodules augmentent de taille.
Contrairement à A. mangium où les plants peuvent être cultivés en tubes de culture
pendant 5 mois sans pertuber leur capacité de développement (Galiana et al.,1990),
l'utilisation d'un dispositif axénique en chambre de culture où tous les paramètres physico-
chimiques peuvent être contrôlés, ne constitue pas pour A. albida un dispositif optimal
favorisant la croissance et le développement des différents organes de la plante. En effet, les
racines ont besoin d'un espace suffisant pour se déployer en un pivot puissant qui peut
atteindre en quelques mois une longueur d'1 mètre (Alexandre et Ouedraogo, 1992) ; le
volume du container étant limité, le développement du système racinaire est réduit. La
partie aérienne n'arrive pas à se déployer et assez vite on constate que l'apex arrive à la
limite du tube et la tige s'enroule sur elle-même.
Il faut noter aussi que les conditions de culture (faible quantité de lumière apportée
par les néons ; modifications du pH du milieu liquide ; milieu de culture absolument
dépourvu d'azote) peuvent entrainer une atténuation ou une absence de réponse à la fixation
de l'azote. Cet état physiologique déficient se traduit par une mauvaise croissance et une
chlorose des feuilles.
3) INFLUENCE DE LA MORPHOLOGIE DU SYSTEME RACINAIRE
Chez A. albida , le système racinaire est généralement pivotant sur sol sableux et
profond avec une racine principale longue et quelques racines secondaires alors que sur sol
hydromorphe ou argileux, la morphologie est tout à fait différente avec un système racinaire
superficiel et traçant (Alexandre et Ouédrogo 1992). En décapitant l'apex racinaire 3 jours
aprés la germination et en inoculant aussitôt aprés, nous avons cherché à déterminer
l'influence de la morphologie racinaire (traçant et superficiel ou pivotant et profond) sur
le potentiel de fixation biologique de l'azote.

141
Par ailleurs, des observations préliminaires, nous ont permis de constater que
l'infection s'effectuait au niveau d'un poil absorbant situé à proximité de l'intersection entre
la racine principale et la racine secondaire. L'ablation de l'apex racinaire pourrait être une
méthode simple d'augmenter la capacité de nodulation et la quantité d'azote fixée qui sont trés
faibles chez A. albida comparée à d'autres espèces telles que Acacia seyal et A. senegal (Badji
et aL, 1992) et Leucaena leucocephala (Sanginga et aL, 1989)
3- 1) Expérience menée en serre
L'ablation de l'apex racinaire a pour effet de supprimer la dominance liée à la
presence de l'apex racinaire et d'augmenter le nombre de racines latérales; en effet de
nombreuses ramifications latérales se développent à la place du pivot principal.
La biomasse séche des racines n'est cependant pas significativement differente au seuil de 5%
de celle obtenue avec les plants dont les racines sont intactes (tabI.N°64).
L'analyse de variance des mesures d'ARA et de la quantitifaction par azote total de la plante ne
montrent pas de différence significative entre les deux traitements seul l'ARA est
significativement différente au seuil de 5%.
De la même manière, le nombre de nodules formés et leur poids sec ne sont pas affectés par
l'ablation de l'apex. L'estimation de l'activité nitrogénasique par réduction d'acétylène
montre que les plants qui n'ont pas subi d'ablation présentent une activité réductrice
d'acétylène plus élevée que les plants ayant subi une ablation (tabI.N°65).
La quantification de l'azote l'estimation de l'azote total par plante, montre une légère
diminution de la quantité d'azote fixée lorsqu'on enléve l'apex racinaire.
3-2) Expérience menée en tubes de culture "in vitro"
A) Efficience
nodulaire
Le tableau N°66 représente l'influence de l'excision de l'apex racina ire sur
les paramètres de croissance et d'efficience de la fixation d'azote révèle que l'ablation de la
radicule avant la culture et l'inoculation n'a pas d'effet significatif sur la croissance en
hauteur et les poids sec des nodules des parties aérienne et racinaire. En effet, en nous
basant sur l'analyse de variance et la comparaison des moyennes par le test de Fischer, les
differences observées
entre plants entiers et plants ayant subi une ablation de l'apex
racinaire ne sont pas statistiquement significatives. Par contre les deux traitements se
différencient par la teneur en azote total par plante.
B) Cinétique de la formation des nodules "in vitro"

Tabl N° 64: Influence de l'ablation de l'apex racinaire sur la croissance de plants d'A. albida inoculés avec
la souche 47.6.4 aprés 12 semaines de culture. L'excision de l'apex survient 3 jours aprés la germination
au moment de la mise en place des semis en pots.
Traitements Hauteur totale
Poids Sec
Poids Sec Part
Poids Sec Part
cm
nodules m
aerienne
m
racinaire
m
Apex entier
20.55 a
235.5 a
194.5 a
14.36 a
Apex coupé
26.18 a
216.47 a
165.62 a
14.7 a
6.93 a
Témoin NI
15,8
b
147,8 b
72,7
0
0
Tabl N° 65: Influence de l'ablation de l'apex racinaire sur l'azote fixé et sur l'azote contenu dans les
differentes parties de plants d'A. albida inoculés avec la souche 47.6.4 aprés 12 semaines de culture.
L'excision de l'apex survient 3 jours aprés la germination au moment de la mise en place des semis en pots.
Traitements ARA (lJMlh/plant)
SARA JlWh/mg
Azote nodules
/plant)
m
Apex entier
514.9 a
71.45 a
0,415 a
Apex coupé
312.2 b
50.61 b
5.6 a
3.05 a
0,297 a
8,947 a
Témoin non inoc
0
0
3,23 b
1,47 b
0
4,7 b
Tabl N" 66: Influence de l'ablation de l'apex racinaire sur la croissance la biomasse et sur la quantité
d'azote total par plant chez A. albida inoculé avec la souche 47.6.4 aprés 3 mois de culture "in vitro"
Traitements
haut tot (cm)
Poids Sec
Poids Sec Partie
Poids Sec Partie
nodules m
aerienne m
racinaire
m
ablation apex
14,77 a
4,33 a
90,8 a
18,19 b
apex intact
15,2 a
4,12 a
116,6 a
22,9 a
5,85 a
Témoin N Inoc
8,4 b
0
64,89 b
17,5 b
2,7 b

Fig IT39: Cirlétique de la fOnTJ.8.tÏün des :L1odu1es diA. .Ut.'IlÎüen tube en fOILCtÏün de l'ablatÏün ou nm..... de l'apex
ITt.cinai:re 3J..lC01J.IS de :3 périodes suivant l'irLOcula.tion. L' excision de l'apex et l' irLOcula.tion avec la souche 47.6.4 ont
eu lieu au moment de la mise en place des plants en tube (m)
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142
Avec l'ablation de l'apex racinaire (fig N° 39), les nodules se forment
sur les racines
latérales nouvellement mises en place (PI 23 Fig A)durant la première semaine; leur
apparition subit un ralentissement au cours de la deuxième semaine puis reprend au cours de
la dernière quinzaine. A l'inverse des plants n'ayant pas subi d'ablation, le nombre de nodules
formés est croissant avec le temps.
3-3) Discussion
La question que nous sommes posés en mettant en place ce dispositif expérimental est la
suivante: le nombre de nodules peut-il être modifié par le nombre de racines latérales?
Chez A. albida le système racinaire est souvent pivotant avec une racine principale trés
longue et seulement quelques racines secondaires. En décapitant l'apex racinaire, avant la
transplantation en pot ( 3 jours aprés la germination), nous avons cherché à déterminer
l'influence de la morphologie du système racinaire (un seul pivot ou bien plusieurs racines
latérales) su'r l'aptitude des plants à noduler et à fixer l'azote.
Certains auteurs se sont particulièrement intéressés à la morphologie du système racina ire
d'A. albida.
Alexandre et Ouedraogo (1992) ont montré que A. albida présente une plasticité
morphogénétique au niveau de son système racinaire qui se développe en un pivot puissant
sur sols sableux où la nappe est trés profonde et qui peut avoir une configuration
superficielle et
tracante occupant les 20 premiers cm du sol lorsque le sol est
hydromorphe.
Selon Alexandre et Ouédraogo l'effet améliorant de l'espèce serait limité lorsque les
conditions de sols sont défavorables à un type d'enracinement pivotant.
Des manipulations en serre par ablation de l'apex racinaire pour éviter l'enroulement du
pivot principal aprés 3 mois de culture se sont révélées défavorables à la croissance de la
plante (Cazet, 1987) ; en effet à la suite de l'ablation de l'apex racinaire, il s'ensuit une
faible émission de racines latérales et une moins bonne absorption d'eau et d'éléments
nutritifs et par conséquent une croissance réduite.
A l'opposé Louppe et Ouédraogo, 1992 ont montré que l'ablation de l'apex racinaire par
desséchement aérien, favorise la formation de nombreuses racines secondaires fines (51 %
de plus par rapport au témoin n'ayant pas subi d'ablation de l'apex) et la formation de
nodules (28%). La croisssance de la partie aérienne n'est pas affectée par l'ablation de
l'apex racinaire.
Nous avons constaté au cours de notre expérience que le nombre de nodules
formés ne varie pas si on augmente artificiellement le nombre de sites potentiels de
nodulation.

143
Libbenga et Bogers, (1974), en confirmant la relation physiologique entre les nodules et
les racines latérales, avaient montré que les nodules des légumineuses se forment
essentiellement au niveau des zones possédant des poils absorbants en élongation et
fréquemment à l'aisselle des racines latérales;
ainsi,
l'excision de la racine principale
favorise aussi bien la nodulation que le nombre de racines latérales. Ils ont par conséquent
déduit de ces observations que les nodules apparaissaient au niveau de points récents
d'activité méristématique en particulier au niveau de point d'émergence de racines latérales.
Il apparait ici que la manipulation du système racinaire bien qu'elle agisse sur la
suppression de la dominance apicale en augmentant le nombre le ramifications latérales,
n'augmente ni le nombre de sites d'infection ni la biomasse raciriaire ni la quantité d'azote
totale cpntenue dans les tissus de la plante. Comme cela a été montré par Vasse et Truchet
1993, il -est ainsi permis de penser que la plante régule elle-même la quantité de nodules
formés en fonction de ses besoins propres.
4) INFLUENCE
DES
RÉSERVES
COTYLÉDONAIRES
SUR
LA
CROISSANCE
ET LA
FIXATION
D'AZOTE
Nous avons cherché à savoir si, d'une part les cotylédons et d'autre part l'addition d'azote
starter étaient indispensables à la croissance initiale des plantes inoculées et par conséquent
si les réserves azotées cotylédonaires pouvaient jouer un rôle d'azote starter pour la plante.
4-1 Paramètres de croissance
Les plants ont été cultivés sur un substrat synthétique formé d'un mélange de perlite
et de vermiculite ; la solution d'arrosage (Jensen) est diluée au 1/4 est dépourvu d'azote.
Les résultats obtenus (Tabl. N°67) nous ont permis de constater une nette superiorité
des
plants inoculés par rapport aux plants non inoculés ainsi que l'effet favorable de
l'inoculation sur le développement du système racinaire qui présente une importante
biomasse et une bonne nodulation chez les plants inoculés.
Le rapport partie aérienne sur partie racinaire est équilibré pour les plants
inoculés (0.9 à 1) alors que l'absence d'inoculation déséquilibre ce rapport au détriment des
parties racinaires (3.2).
L'ablation totale ou partielle des cotyledons affecte de manière sensible la croissance
en hauteur des plants avec 26,5 cm pour les plants entiers et seulement 16,3 cm pour ceux
qui ont subi une ablation (fig N° 40).

Tabl N° 67:
Influence de l'ablation des cotylédons d'A. albida et de l'addition d'azote starter sur la
biomasse produite au niveau des differentes parties de plants d'A. albida inoculés avec la souche 47.6.4
aprés 1S semaines de culture.
Traitements
Hauteur Tot
Pds sec Partie
Poids sec
Ratio
cm
Aerienne m
Partie
rac. m
PAIPR
cotyl entiers
26,5 a
252 a
263,9 a
0,9
coty 1/2
21,1 a
190,9 b
197,5 b
7,9
b
0,96
sans cotyl
16,3 b
159,2 b
135 b
4,8
c
1,17
Azote starter
19,33 b
153,4 b
136,6 b
6,12 b
1,12
Témoin Non
15,8 b
147,8 b
72,7 c
°
3,2
Inoculé
Tabl N° 68 : Influence de l'ablation des cotyledons et de l'addition d'azote starter sur la teneur en azote
total des differentes parties de plants d'A. albida inoculés avec la souche 47.6.4 aprés 1S semaines de
culture.
traitements ARA(nMole/h/pl)
SARA(nMole/h/mg
Azote Partie
/pl)
aer. m
cotyléd entiers
426 a
39,8 b
6,04 a
cotyl 1/2
263,3 b
32,4 b
3,34 b
3,35 b
0,351
7,05
sans cotyl
·286 b
66,19 a
4,7 a
2,7 b
0,1708
7,57
Azote starter
394 a
64,13 a
4,4 a
2,45 b
0,46
7,31
témoin Non
°
°
3,23 b
1,47 c
°
4,7 c
Inoculé

Fig Na40 : Influence de l'ablation totale ou partielle des cotylédons sur la croissance en hauteur de plants
d'A. .ù'bidacultivés en serre avec la souche 47.6.4 aprés 15 semaines de culture.
300 -
/
2S0 -
200 -
l
/
.l!l
IS0 -
...2~J 100-
SO -
0
1
1
......2>-~..""'~
Fig Na41 : Influence de l'ablation totale ou partielle des cotylédons sur la biomasse de plants d'A. .llbid.l
cultivés en serre avec la souche 47.6.4 aprés 15 semaines de culture.
o Poids sec P. aérielUle
300
III Poids sec P. racinaire
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Fig N'42 : Int11Jence de l'ablation 1Dt.ôle ou partielle des cotylédons SUI la quanti:t.é d'azote fh:é (ARA) de planf1l d' Ao
iYl~.~li~irlOcuJéS en serre a1lec la 301JChe 470604 aprés 15 semaines de culture0
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Fig: N' 43: Inl1uerLCe de l'ablation tDtale 011 partielle lies cotylédorlS sur la qUillltité d' azote fixé totale de plarlts li1 A.
itlbJi!dinoculés en serre I}lrec la sour.he 47.6.4 a.pres 15 semaines de c1JltlJre.
15 _.O'c
0'0 Ni' .oU:R
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~:
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144
De même par rapport à la productivité en biomasse déterminée par les poids secs des
parties aériennes et racinaires, les cotylédons semblent indispensables à un bon
développement (fig N° 41) . En effet, l'excision des cotylédons affecte la croissance des
tiges et des racines, la chute de la biomasse racinaire et aérienne est respectivement de 24.6
% et de 36.9 % pour une ablation partielle et une ablation totale.
Nous avons pu constater que la présence des cotylédons excerce une influence directe
sur la formation des nodules puisque leur poids sec diminue de façon sensible avec l'ablation
des cotylédons.
L'apport d'une quantité relativement faible d'azote 7 jours aprés l'inoculation aux plants
entiers .ayant conservé leurs cotylédons, n'améliore pas les paramètres de croissance par
rapport au traitement ou les cotylédons sont intacts mais qui n'ont pas reçu d'engrais azoté.
On note un effet dépressif sur les paramètres de croissance en hauteur et sur les paramètres
de biomasse végétale (poids sec des parties aériennes et des racines).
4-2) Quantité d'azote fixée
Les valeurs d'activité réductrice d'Acétylène (fig N° 42) sont significativement plus
élevées en présence des plants entiers n'ayant pas subi d'ablation des cotylédons (Tabl.N°
68).
'L'ARA spécifique (SARA) qui détermine la quantité d'azote fixée par mg de nodule sec donc la
valeur de l'ARA rapportée au poids sec des nodules formés, est beaucoup plus élevée chez les
plants ayant subi une ablation totale des cotylédons (66,19)
que chez les plants entiers
(39,8) et les plants ayant subi une ablation partielle (32,4).
4-3) Azote total
Si la méthode par réduction d'Acetylène constitue un bon outil de comparaison du
pouvoir fixateur des différents traitements, le dosage de la quantité d'azote contenue à
l'intérieur des tissus est un critère de choix pour compléter la mesure de l'efficacité de la
fixation. Les paramètres tels que le poids sec des racines, l'azote des racines et l'azote total
par plant discriminent bien les différents traitements entre eux (fig N° 43).
Les plants entiers
présentent une biomasse racinaire importante, une bonne
nodulation, et une teneur en azote des racines élevée (4.62 mg). Le témoin entier mais non
inoculé présente une teneur en azote total de 4.7 mg /plant ; le milieu d'arrosage étant
totalement dépourvu d'azote ainsi que le substrat de culture, cette quantité d'azote dosée

Tabl. N" 69 :Matrice de corrélation des paramètres mesurés concernant l'influence de l'ablation totale ou
partielle des cotylédons de plants d'A. albida inoculés en serre avec la souche 47.6.4 aprés lS semaines
de culture.
Matrice de corrélation pour les variables : Xl.·· Xl 0
haut tot
PS PA
PS Pr
PSnod
ARA
SARA
Al PA
Al PR
haut tot
1
PS PA
,95
1
PS Pr
,95
,95
1
PSnod
,93
,88
,98
1
ARA
,69
,56
,74
,86
1
SARA
, 1
6,61 E-4
,25
,42
,78
1
Al. PA
,67
,7
,68
,72
,77
,51
1
Al PR -
,93
,94
,99
,98
,77
,31
,76
1
Alnod
,94
,94
1
,97
,72
,23
,64
,99
Al tot
,87
,9
,92
,92
,8
,4
,91
,96,
*Ht= hauteur totale (mm)
*PSPA = Poids sec des parties aériennes (mg)
*PS PA = Poids sec des parties racinaires
*PS nod= Poids sec des nodules (mg)
*ARA = Activité réductrice d'Acétylène (nM/h/plant)
*SARA= Activité réductrice d'Acétylène spécifique (nM/h/mg de nodule sec)
*Al PA= Azote des parties aériennes (mg)
* Al PR= azote des parties racinaires (mg)
*Al nod= Azote des nodules (mg) Al total = azote PA+Al PR +Al nod (mg)

145
provient essentiellement des cotylédons. Sur les plants entiers inoculés, le dosage de l'azote
donne des valeurs de 11,17 mg d'azote total/plant; la difference entre plants inoculés et
plants non inoculés liée à la fixation d'azote est de 6,47 mg .
Si on compare les valeurs obtenues pour les plants inoculés entiers (1 1,1 7 mg) et
les plants inoculés mais totalement dépourvus de cotylédons (7,57 mg ), on constate que la
différence dûe à la présence des cotyledons est de 3.6 mg ; on retrouve une valeur tres
proche ( 4.7 mg) en présence du temoin entier non inoculé.
L'apport d'azote provenant de la fixation et à celui contenu dans les nodules est ici de
6,47 mg alors que l'azote apporté par les cotylédons est évalué à environ 4.7 mg.
D'autre p-art il n'est pas tout à fait exclus que la présence des cotylédons n'exerce pas. une
influence directe sur la formation et l'efficience des nodules car leur poids sec,
l'ARA
diminuent de facon sensible en l'absence des cotyledons.
Les valeurs obtenues en matière de quantité d'azote total par plante à la suite de l'addition
d'azote starter, ne sont pas significativement différentes de celles obtenues dans le cas d'une
ablation partielle ou totale des cotylédons; en effet l'apport d'azote a un effet dépressif et
inhibiteur sur la nodulation et la quantité d'azote fixée par les plantes.
Les paramètres d'azote total et d'azote des différentes parties sont positivement corrélés avec
ceux des biomasses aérienne, racinaire et nodulaire; à l'inverse les valeurs d'ARA et de
SARA ne sont pas significativement corrélées avec celles relatives à la biomasse et à l'azote
contenu dans les tissus de la plante (TabI.N°69).
4-4 ) Discussions
A) Influence des cotylédons
L'inoculation favorise un rapport partie aérienne / partie racinaire trés équilibré
alors que l'absence d'inoculation déséquilibre ce rapport au détriment du système racinaire.
L'inoculation, en crééant un environnement favorable au système racinaire induit une
réponse positive se traduisant par une augmentation de la biomasse racinaire.
On pourrait voir là un effet adaptatif de A. albida à un environnement sahélien trés sec au sol
appauvri (Duhoux et Dommergues, 1988) ; la survie de l'espèce dans ces conditions dépend
principalement de sa capacité à mettre en place et à développer un système racinaire
suffisammant important et puissant qui lui permet d'aller puiser les éléments nutritifs
(eau, hydrates de carbone, éléments minéraux ) là ou ils se trouvent (Dreyfus et
Dommergues,1 988; Alexandre et Ouédraogo, 1992)). C'est ce qui explique que trés souvent
lorsque A. albida s'implante, il développe en priorité son système racinaire.

146
Trés peu de travaux ont été réalisés sur le rôle que joueraient les cotylédons en tant
qu'organes de réserves azotées. On peut citer les travaux de Matthews et aL, (1987)
effectués sur des mutants nonnodulants de soja qui ont montré que l'ablation totale des
cotylédons ne permet pas de lever l'inhibition. Chez A. senegal, (Badji, 1986), en comparant
la teneur en azote des parties aériennes des plants inoculés et celle des plants non inoculés et
qui n'ont pas recu d'apport exogéne d'azote, il apparait que 56% de l'azote contenu dans les
tissus aériens proviennent des cotylédons.
Les observations effectuées à partir de nos expériences nous amènent à constater que
les cotylédons chez A. albida agissent doublement :
- directement sur la croissance par la mobilisation des substances de réserves
et la mise en place des structures et organes végétatifs (Matthews et aL, 1987).
Les cotylédons d'A. albida contiennent une forte proportion d'azote (4,5%) ce qui constitue
un des taux les plus élevés par rapport aux autres espèces telles que A. nilotica , A.
sieberiana et A. tortilis (Reed et aL, 1992. Les cotylédons assurent la nutrition azotée
pendant les 3 à 4 premières semaines de croissance de la plante; en effet nous avons constaté
qu'à partir de la 4 ème semaine, les cotylédons deviennent
plats et minces, jaunissent,
s'enroulent sur eux-mêmes et finisssent par se détacher et tomber. La quantité de substances
de réserves, contenues dans les tissus cotylédonaires et libérées à la germination et au cours
des premières étapes du développement de la plante, est suffisante pour assurer à celle-ci
une croissance optimale.
La mobilisation des réserves cotylédonaires est aussi sous le contrôle des gibbérellines qui
en activant certaines enzymes, des hydrolases, amylases, B- Glucanase, Phosphatase-acide,
ribonucléase etc ... , synthétisent des produits qui migrent vers l'embryon et plus tard vers
vers la plantule où ils seront utilisés pour l'édification des structures et la satisfaction des
besoins energétiques (Helier, 1991 ).
Il apparait ainsi que chez Acacia albida, les cotylédons jouent un rôle essentiel dans le
développement de la plante au cours des premiers stades de croissance. Ils agissent aussi bien
sur le développement de la partie aérienne, du système racinaire que des nodules.
La bonne croissance des plants n'ayant pas subi d'ablation est liée principalement à la
présence des cotylédons ; à l'inverse l'absence de cotylédons entraîne une mauvaise
croissance des plants.
- indirectement en stimulant probablement grâce aux phytohormones
synthétisées ou accumulées (Torrey, 1986; Hirsch,1 992), la nodulation et par là
l'accumulation d'azote dans les tissus de la plante. Les cotylédons influent sur la nodulation
puisque le poids sec de nodules diminue à la suite de l'ablation. Cette influence se traduit içi
par des valeurs de l'ARA plus élevées lorsque les cotylédons sont intacts.

147
On peut noter une interaction trés nette entre cotylédons, nodulation et la croissance
lorqu'on considère la biomasse (Poids sec parties aérienne, Poids sec des parties racinaires
), l'ARA et l'azote total par plant.
B) Influence de l'addition d'azote starter
De faibles quantités d'azote utilisé comme azote starter (Rigaud, 1981) sont souvent
apportées afin de satisfaire les besoins en matière azotée durant la période où les réserves
cotylédonaires sont déja utilisées et la fixation d'azote n'est pas encore effective; en effet
durant cette phase de durée variable, le développement de la plante est tributaire de la
disponibilité en éléments minéraux fondamentaux en particulier l'azote; les nodules en phase
de crois~ance ne sont pas encore suffisamment effectifs pour apporter à la plante tout l'azote
dont elle-a besoin; d'autre part les sols étant en général carencés en azote, l'addition d'une
faible quantité d'azote est souvent nécessaire pour permettre à la plante de surmonter cette
phase critique.
Chez Leucaena leucocephala, l'addition d'azote starter est indispensable à une bonne
croissance et une bonne fixation (Sanginga et al.,1988).
L'addition de sulfate d'ammonium chez des plants d'A. albida, une semaine aprés l'inoculation,
à la dose de 1,3 mM/l, n'améliore pas les paramètres de croissance par rapport au
traitement avec cotylédons et sans azote starter; on note un effet dépressif sur les facteurs
de croissance et de biomasse. Les valeurs obtenues en matière d'azote total des plantes à la
suite de l'addition d'azote ne sont pas significativement différentes de celles qu'on obtient à la
suite d'une ablation partielle des cotylédons; en fait l'apport d'azote a un effet inhibiteur sur
la nadulation et la quantité dazote fixée.
Notre expérience arrétée au bout de 14 semaines, a montré que les réserves cotylédonaires
sont suffisantes jusqu'a cette période pour assurer une bonne croissance des plants d'A.
albida et que l'azote starter apporté une semaine aprés l'inoculation n'est pas nécessaire à la
croissance et induit un effet dépressif sur la fixation d'azote.

148
5) ETUDE DES PREMIERS STADES DE l'INFECTION RACINAIRE PAR
BRADYRHIZOBIUM
SP. CHEZ A. ALBIDA
Nous avons effectué des observations sur une vingtaine de fragments de racines d'A.
albida 10 jours aprés l'inoculation avec une souche de Bradyrhizobium 47.6.4 ; aprés
éclaircissement à l'hypochlorite de sodium et coloration au bleu de méthylène (Truchet et
a1.1989), les observations au microscope en
contraste de phase
nous ont permis de
visualiser les tout premiers stades de l'infection.
La présence de la bactérie induit une réaction typique d'enroulement en crosse dite
"de Shephard" d'un poil absorbant trés court (PI. W24 fig A).
Le nqmbre de poils infectés est trés faible par rapport au nombre total de poils absorbants
formés sur la racine ce qui limite leur observation; on discerne facilement les autres poils
absorbants non déformés qui sont en doigt de gant et surtout colorés en rose alors que les
poils déformés sont colorés par le bleu de méthylène en raison de la présence d'un cordon
d'infection.
Au centre du poil, dans la région interne de la courbure, on distingue un point plus
coloré que le reste, qui détermine le point d'entrée de la bactérie. Le cordon d'infection qui
est coloré en bleu se déplace verticalement vers la base du poil, au niveau de la cellule
corticale adjacente au poil; puis il s'oriente horizontalement paraléllement au grand axe des
cellules parenchymateuses corticales (PI. N°24 fig B).
A quelque distance du poil infecté, se forme un primordium nodulaire (PI. W25 Fig
B) : des cellules situées tout contre les cellules adjacentes aux vaissaux conducteurs au sein
du cortex interne, entrent en division active pour donner un amas de cellules de petite taille
en forme de dôme qui évoluent plus tard vers un nodule méristématique. Le cordon d'infection
continue sa migration en direction du méristème nodulaire (PI. N°25 fig A et B)
qu'il
envahira plus tard en déversant son contenu à l'intérieur des cellules nouvellement formées.
Sous la loupe, il est possible d'observer l'émergence du nodule qui se fait au dépens
des tissus du cortex aprés fissuration de l'épiderme supérieur (PI 26 Fig A) . Ici on peut
noter l'émergence de trois massifs méristématiques.
Sur les jeunes nodules, (agés d'une vingtaine de jours) nous avons observé une
structure nodulaire sphérique (PI 26 Fig B) constituée d'une zone périphérique
parenchymateuse contenant les vaisseaux conducteurs, d'un cortex avec des cellules
vacuolisées et d'un tissu central constitué de petites cellules uninuclées envahies par les
rhizobium à côté de cellules non envahies: les cellules interstitielles (PI 28 Fig A et B).
Cette morphologie et structure sont caractéristiques de nodules de type déterminé tel qu'on
l'observe chez le soja (Newcomb ,1981).

148
Cette morphologie et structure sont caractéristiques de nodules de type déterminé tel qu'on
l'observe chez le soja (Newcomb ,1981).
Lorsque le nodule devient âgé (1 à 2 mois), il s'allonge et se ramifie trés souvent (PI 26 Fig
B) . La persistance de nombreux pôles méristématiques favorise une activité continue et par
la suite des divisions successives, de nouveaux lobes apparaissent; ce qui donne la
morphologie allongée et multilobée des nodules d'A. albida (PI 27 Fig A, B et C).
Sur ces nodules plus agés, la structure se modifie, le nodule de forme sphérique devient plus
allongé et présente plusieurs lobes qui représentent chacun un pôle méristématique. Les
cellules infectées se situent au centre du nodule, en face de ces pôles méristématiques (PI 28
Fig C).
DtSCUSSIONS
L'interaction entre la bactérie et les tissus racinaires de la plante aboutit à la formation
d'un nodule. Chez A. albida, la première réaction visible de reconnaissance entre la souche
et la plante est la déformation en crosse d'un poil absorbant trés court; par cette voie, la
bactérie est emprisonnée dans une boucle et pénétre la cellule du poil aprés invagination de
la membrane plasmique du poil.
L'invasion et l'infection par poils absorbants concerne un nombre trés faible de poils (sur
20 000 poils seuls 2,8% se trouvent être infectés par chez le pois (Herack, 1964); il n'est
pas étonnant que les études structurales aprés fixation et inclusion, ne puissent pas toujours
révéler le début de l'invasion . La plupart des études menées dans ce sens utilisent le
microscope à contraste de phase qui permet d'observer les poils absorbants infectés et
colorés de manière spécifique (Dart, 1977; Newcomb, 1981), car la probabilité pour que la
coupe passe au niveau d'un poil absorbant infecté dans un angle de coupe permettant de
l'identifier de manière certaine est certainement faible.
Il est à noter que chez A. albida aussi (Dupuy, 1993), les poils absorbants infectés sont trés
peu nombreux, raison probable du faible nombre de nodules observés chez cette espèce par
rapport aux autres espèces de légumineuses.
Normalement un poil absorbant est généralement rectiligne et posséde une forme en doigt de
gant; l'inoculation avec une culture pure de Rhizobium produit une déformation et un
enroulement en crosse.
Ce modéle d'infection, où le développement du nodule débute avec l'invasion d'un poil
racinaire par le Rhizobium, est assez courant et se rencontre chez de nombreuses espèces de
légumineuses tropicales comme tempérées.
La crosse de Shephard est caractéristique de la plupart des légumineuses tempérées
(Dart,1974; Callagham et Torrey, 1980; Bauer, 1981) et de certaines légumineuses
tropicales telles que le soja (Turgeon et Bauer 1985; Newcomb et aL, 1979; ) le Leucaena

149
leucocephala (Chen et Rolfe, 1988) l'Acacia senegal (Badji, 1991) et Acacia mangium
(Prin et Reddell,1994).
Un important travail de cytologie a été effectué par Dupuy (1993) afin d'élucider le
processus de l'infection ainsi que la morphogénèse du nodule chez A. albida ; en effet l'auteur
a identifié, à partir de coupes de racines d'A. albida, des Rhizobium enchassés dans un cordon
d'infection et se développant dans des poches intercellulaires au niveau de l'assise corticale.
Ces cellules corticales· ont un aspect hypertrophié et possèdent une base élargie en une sorte
d'ampoule ; le PC?int de contact d'une cellule corticale hypertrophiée avec la cellule
épidermique adjacente délimite un espace ou une poche au niveau de laquelle les bactéries
sont emprisonnées par le cordon d'infection.
Le cqrdon est initié au niveau de cette cellule corticale hypertrophiée, progresse vers la base
du poil absorbant en empruntant les ponts cytoplasmiques (Dupuy 1993).
Pour notre part, les racines d'A. albida inoculées que nous avons observées montrent
nettement le poil absorbant trés court enroulé en crosse. Comme cela a été démontré chez A.
senegal et Leucaena leucocephala, la presence de la souche de Rhizobium induit une réaction
de déformation et d'enroulement du poil typique. C'est au centre de la courbure au niveau d'un
point réfringeant que se trouvent enfermées les bactéries. La fonction biologique essentielle
de l'enroulement du poil absorbant
réside dans l'enchassement et le confinement des
Rhizobia dans cette poche située entre les parois de la cellule du poil ( Bauer, 1985).
S'agirait-il de deux processus d'infection différents mis en place par l'espèce, le premier
étant de nature intercellulaire alors que le second serait intra-cellulaire?
A notre avis, ces observations à partir de coupes réalisées sur les racines infectées,
bien qu'elles n'excluent pas le rôle initiateur joué par la cellule du poil absorbant dans les
premières étapes de l'infection, n'ont pas montré une étape primordiale qui est l'étape de
déformation du poil absorbant et l'initiation du cordon d'infection. Nous pensons que A. albida
ne se différencie pas de la plupart des légumineuses tropicales appartenant au groupe des
Mimosacées telles que A. senegal A. mangium et Leucaena leucocephala, chez lesquelles
espèces la voie intra-cellulaire classique demeure le mode privilégié de pénétration des
Rhizobium.
Nous avons aussi montré que la présence du cordon d'infection induit à distance la
formation d'un primordium nodulaire au niveau du cortex interne racinaire.
Ici l'initiation des mitoses s'effectue à partir de cellules du cortex interne au niveau de la
deuxième assise de cellules du parenchyme cortical adjacente au tissu conducteur. Comme
c'est le cas chez la plupart des espèces de légumineuses tempérées infectées par voie intra-
cellulaire au niveau du poil absorbant, (Denarié et al.,1992; Newcomb et aL, 1979; Truchet
et al.,1978)
et certaines légumineuses tropicales (Sprent et de Faria, 1988; Vasse et

151
et aL,1978)
et certaines légumineuses tropicales (Sprent et de Faria, 1988; Vasse et
Truchet, 1989), le méristème nodulaire est initié à partir du cortex interne comme chez
Sesbania rostrata (N'Doye et aL, 1994).
Le jeune nodule d'A. albida présente une structure type de nodule à croissance déterminée
telle qu'on la retrouve chez la plupart des espèces tropicales (Glycine max, Newcomb et aL,
1979) qui à la suite d'une infection via les poils absorbants, forment des nodules sphériques
ayant une activité méristématique limitée dans le temps et dissociée de la fonction de
fixation.
En effet, comme l'a montré Dupuy, (1994) chez A. albida , les jeunes nodules, agés d'une
vingtaine de jours présentent une structure sphérique constituée d'une zone périphérique
parenchymateuse, d'un cortex avec des cellules vacuolisées et d'un tissu central constitué
d'un mélange de petites cellules infectées à côté de cellules non infectées: les cellules
interstitielles. Lorsque le nodule devient agé, il se présente sous la forme allongée et
multilobée caractéristique du nodule méristématique à croissance indéterminée bien que les
coupes ne révèlent pas la zonation classique (zone mérsitématique, zone d'invasion, zone de
fixaion et zone sénescente).
Ces deux types morphologiques à des âges differents chez la même espèce, montre que
le nodule d'A. albida est à croissance mixte, déterminée au jeune âge et indéterminée à l'âge
adulte. Cette morphologie mixte a déja été décrite par Dupuy en observant des nodules d'A.
albida âgés de 30 jours. Cette structure n'est pas propre à A. albida puisque chez Sesbania
rostrata un phénomène identique (N'Doye et aL, 1994) a été observé.

Planche
W24
Premiers stades de l'infection chez A. albida
Fig. A : Observation aprés étalement d'une racine d'A. albida infectée par
Bradyrhizobium ; on observe un poil absorbant trés court, enroulé en crosse. Le
point sombre (~ détermine le point d'entrée de la bactérie. Les poils absorbants
non infectés sont en doigt de gant et colorés en rose par le bleu de méthylène.
(Pai : Poil absorbant infecté). (Gr. x 20)
~ : Photo de surface d'une racine d'A. albida infectée par Bradyrhizobium ;
détail du poil absorbant infecté (Pai), trés court replié sur lui-même et noter les
lignes bleues qui matérialisent la migration latérale du cordon d'infection au sein
. des cellules corticales .(Gr. x 20)

®
A
8

Planche N° 25
Infection chez A. albida
premières étapes de la formation du nodule
Fig. A: Le cordon d'infection est coloré en bleu et dichotomisé; il chemine
latéralement en direction d'un proméristème nodulaire (PN) qui émerge à partir
des tissus du cortex interne (c.i.) (Gr. x 10).
~ : Détail d'un promérîstème nodulaire observé sur une racine d'A.
albida infectée par Bradyrhizobium ; les cellules corticales proches des cellules
conductrices (
) se divisent et s'organisent en dôme méristématique (d.m.). (CC:
Cellules conductrices; PN: parenchyme cortical; PN: proméristème nodulaire)
(Gr. x 20)

A
,~~~~~~~\\.
··~i:~j~~:>.
B


Cltures d'A. albida
odule méristématique multilobé (Gr. x 2,5)
et de nodules multilobés.(Gr. x 10)
Iules se développent trés souvent à l'intersection entre le pivot et les
~es .(Gr. x 2,5)
Il

®
A
B
G

F anche
W28
Structure al ,ltomique de nodules d'A. albida observée au
microscope
optique
Fig. A: ( ~upe anatomique d'un jeune nodule d'A. albida ; il est arrondi et
constitué de C lux parties: une partie externe périphérique non infectée et une
partie interne
~ntrale contenant des cellules infectées ( CN : cortex nodulaire; CI
1
: Cellules infec ées) (Gr. x 125)
Fig. B:
etail de la structure d'un jeune nodule d'A. albida
La partie péril hérique est constituée de cellules parenchymateuses (P C) non
infectées cont_ lant de nombreux tannins.
Au centre on
!bserve un ensemble de cellules infectées entourées de cellules
interstitielles r ~n infectées (Cin). Dans cette zone les tannins sont pratiquement
absents .(Gr.: 200)
Fjg. C: ,Nodule d'Acacia albida agé de 2 mois environ. Noter la formation
d'un nouveau
ibe; on peut observer de grandes poches au contour épais contenant
des cellules inf ctées entourées par des cellules non infectées.
Elles sont ent, urées d'une gaine épaisse et trés colorée probablement issue du
cordon d'infec ion, aux bords internes irréguliers. A l'intérieur de ces poches, on
peut observer une matrice dense d'aspect grumeleux et de trés nombreux et
volumineux no aux. Chaque noyau est cependant individualisé au sein de la masse;
en effet il s'e t entouré d'une fine membrane qui contient le protoplasme de la
cellule dont le loyau est originaire. Cette structure nodulaire est assez fréquente
sur les échant Ions agés observés. (Gr. x 600)

A
8
G

CONSIDERATIONS
GENERALES

152'~
CONSIDERATIONS
GENERALES
1
i
Dans le cadre de l'amélioration génétique, nous avons choisi de travailler sur deux voiesl
identifiées comme des voies incontournables dans des schémas d'amélioration variéiale.
'
La première voie qui est la voie classique, consiste à mettre en place des prb9,l'ammes<
d'amélioration génétique basés sur la reproduction séxuée et grâce à des crbi~ements
'êontrôlés, arriver à créér de nouvelles combinaisons et produire des génotypes Jrésentant
u~e bonne aptitude à la combinaison. Dans ce ~chéma, les gains génétiques attendu~ au fil des
générations d'amélioration sont progressifs (avec un enrichissement progressif de ,la
population de base en alléles nouveaux).
La seconde voie consiste à propager végétativement les individus "plus" sélectionnés; les
gains génétiques sont immédiats.
En fait, dans la nature, A. albida utilise deux stratégies pour se propag~r dans son habitat:
1) 'la reproduction sexuée grâce à la fécondation avec un mode de reproduction!
allogame qui favorise la recombinaison des génes. C'est une source importante de variabilité
qui
favorise en même temps l'adaptation et la survie de l'espèce lorsque les conditions
environne~entales changent. Cette stratégie est à long terme car elle assure la survie et
l'évolution de l'espèce.
2) A, l'inverse de la reproduction séxuée, la multiplication végétative P~Jr
drageonnement assure la conquête rapide de l'espace disponible et assure la stabilisation
d'une combinaison génotypiquedans un type d'habitat déterminé.
En expérimentant, nous nous sommes inspirés de ces constatations et avons' cherché: à
profiter de ces expériences toutes faites par la nature et tirer des ens~ignements sur les
différents mécanismes adaptatifs adoptés par l'espèce.
Tout schéma d'amélioration basé sur les croisements est soutendu par une bonne
connaisssance de base en matière de biologie de la reproduction; cette connaissance couvre les
domaines de la biologie florale, de la floraison, de la fruitaison et du mode de fécond~tion
allogame ou autogame.
Au cours de notre travail, nous avons montré que chez A .albida l'unité repro~uctrice.
est non pas la fleur mais l'inflorescence toute entière; en effet l'inflorescence se c?mporte
comme une unité fonctionnelle où les fleurs basales en s'ouvrant les premières attirent les
.
,
'
insectes pollinisateurs pour qu'ils pollinisent
les fleurs situées à l'extrêmité, qui solit les
plus réceptives.
Il existe une étroite relation entre le nombre de monades par polyadeet le nombre ,d'ovules
par ovaire; en effet on constat~ que chez les Acaciae et les Mimosacae en général, le nombre:
de monades par polyade dépasse trés souvent le nombre d'ovules par carpelle; la signification!
i

153 ,:;
de cette relation ~st que l'espèce tend à assurer la fécondation de ,la totalité des ovules
contenus dans un carpelle au cours ,d'un seul événement pollinatoire; nous avons aussi
constaté que il arrive parfois qu'un stigmate reçoive 2 à 3 polyades ce qui tend à élever le
,
.
rapport monade / ovule de 1,5 à 4,5.
Le mode de fécondation allogame ou autogame permet de comprendre comment les
gènes sont échangés au sein des populations et· d'en déduire par conséquent la structure
génétique de la population. A. albida comme la plupart des Mimosacées jusqu'à présent
étudiées, est une espèce à mode de reproduction allogame, privilégiant un niveau élevé
d'hétérozygotie. La plupart des espèces forestières sont des espèces qui se reproduisent dans
un système de panmixie générale qui favorise d'une part la recombinaison entre alléles et.
d'autre part, l'accumulation d'allèles favorables. Ce système assure la pérennité de l'espèce
en augmentant ses capacités adaptatives.
Le grain de pollen qui constitue un gamétophyte réduit, est trés souvent libéré sous' une
forme partiellement déshydratée; le pollen ne se conserve naturellement
que quelques
heures et chez A. albida , il se conserve quelques jours.
Nous avons montré que le pollen d'A. albida est capable de germer et d'émettre des tubes
polliniques lorsqu'il cultivé sur un milieu optimal de Brewbaker et Kwacks.
L'intérêt d'étudier les conditions de stockage à long terme (1 an et plus), en' utilisant
les méthodes cryogéniques (Stanley et Linskens, 1974) ou la Iyophiliation (Cerceau-
Larrival, 1989) apparait évident lorsqu'on cherche à mettre en place des plans· d~
croisement en utilisant du pollen récolté sur des arbres trés distants les uns des autres au
niveau de l'aire géographique et où la nécessité de conserver le pollen s'impose..
En utilisant le test fluorochromique (FCR), il est possible de tester l'intégrité fonctionnelle
.
!
du pollen conservé soit par cryogénie soit par Iyophyl,isation et avoir une bonne prédiction
du taux de germination des monades "in situ" et par conséquent du rendement de I~
i
fécondation.
!
La seconde stratégie porte sur la propagation végétative et l'amélioration des
potentialités physiologiques grâce à la symbiose fixatrice d'azote..
Il est admis que. la sélection d'arbres "plus" au sein des populations naturelles et leur
clonage en vue de la mise en place de plant,ations c10nales individuelles est la voie la plus
rapide pour l'amélioration génétique des arbres forestiers.
Au sein des populations naturelles d'A. albida la propagation végétative n'aturelle par la voie
du drageonnage est fréquente; il n'est pas rare de constater que deux pieds peu éloignés l'un
de l'autre sont en fait des clones issus du drageonnage des racines.
La propagation in vitro" des arbres adultes emprunte cette voie naturelle en utilisant
comme explants primaires des drageons qui réagissent trés bien à la stimulation caulogéne. i
Au cours de nos expériences, nous avons pu constater la persistance dans les tissus adultes de
phénomèmes encore mal maîtrisés liés à la maturation; cette maturation induit de profonds

154
changements au niveau du co~trôle génétique du développement médstèmatique alliés à de~
modifications relativement superficielles tendant à modifier l'environnement nutritionnel e~
hormonal des tissus.
!
1
Au moment de la phase d'introduction, nous avons pu constater que le rythme annu~l
de croissance découlant des saisons, influe sur la
culture et sur l'expressioh
morphogénétique "in vitro" chez A. albida. C'est seulement pendant la phase active d~
croissance végétative et pendant la floraison que les méristèmes axillaires réagissent le plus
favorablement à la caulogénèse .
L'effet de la maturation se manifeste en cours de culture, avec l'apparition de phénomènes de
jaunissemnent suivis de .Ia chute des feuille~. Ces manifestations apparaissent quelles que
soient la nature du milieu et les conditions d~ culture. L'addition de Phloroglucinol ou la sub-
cult:ure fréquente peut retarder ce phénomèhe jusqu'à 55 à GO jours, mais en aucun cas ne
peuvent l'enrayer.
D'autre part, la persistance de phénoménes morphogénétique's endogénes encore difficiles à
identifier et qui sont la conséquence d'une maturation des tissus, entraine chez les clones
1
.
introduits "in vitro", une croissance épisodique aléatoire et difficile' à stabiliser (Gassama
et al., 1995 soumis).
Ainsi, la voie qui consiste à utiliser des clones issus d'arbres adultes dans une perspective
d'actions de développement, ne permet pas à l'heure actuelle d'obtenir du matériel homogéne
en grande quantité et dans un délai relativement ~purt. L'absence de données relatives aux
moyens d'inverser la tendance vers une courbe de croissance positive, constitue un sérieux
handicap . et devrait faire l'objet de recherches plus poussées avant d'envisager une
utilisation opérationnelle dans les programmes de développement.
Par contre, le matériel juvénile présente d'importantes potentialités. En exploitant
la faculté naturelle d'A. albida à émettre des drageons, nous avons réussi à regénérer des
plantes entières acclimatées à partir de racines excisées. Les racines constituent un matériel
de choix d'une part, par le taux élevé de multiplication obtenu à partir d'une faible quantité
de matériel végétal, la vigueur des pousses qui en sont issues et d'autre part par le rple
important qui leur est dévolu en tant que "pôle primordial de la juvénilité".
Dans l'hypothèse que les pousses feuillées obtenues par culture de racine sont conformes à
l'ortet initial (cette hyppothése est tout à fait raisonnable car il est admis que le
bourgeonnement adventif produit naturellement lors du ,drageonnement des racines n'est
qu'une exp'ression de la plasticité morphogénétique puisqu'il ne fait que révèler des
potentialités habituellement masquées lors du développement normal), on peut val,ablement
envisager d'utiliser le matériel juvénile dans une perspective de clonage à grande échelle.
En effet, en utilisant la culture de racines excisées chez A. albida , il est possible d'~btenir
dans les conditions optimales de culture à partir d'une seule racine, 138 plantules en 4
semaines.
-

155
La stratégie d'amélioration à promouvoir dans l'état actuel des connaissances chez A. albida'
est une stratégie basée sur l'obtention de variétés améliorées issues de croisement~ ~ntre
individus sélectionnés et la propagation de ces variétés améliorées par voie de clonage ;, in
. ".
vitro". L'hybridation intra et inter,spécifique serait une alternative intéressante permettant
d'obtenir du matériel de qualité en raison des avantages sélectifs naturels en faveur d'un
niveau ,élevé d'hétérozygotie.
L'utilisation des arbres fixateurs d'azote atmosphérique dans les sytèmes agro-
forestiers ou sylvo-pastoraux, suscite un
grand intérêt en raison de la dégradation des
facteurs de fertilité des sols tropicaux.
En étudiant la nutrition minérale azotée nous avons montré en utilisant plusieurs Clones
. 1

d'individus cultivés en' présence de diverses sources de matière azotée que I~ forme
.
,
ammoniacale et dans une moindre mesure la glutamine, sont trés facilement convertibles en
biomasse foliaire et raciriaire chez A. albida . Ceci constitu~ un avantage non négligeable
lorsqu'on sait que l'espèce faiblement fixatrice d'azote, se développe préferentiell~mént en '
assimilant l'azote du soi et ne concurrence pas les espèces céréalières qUI utilisent elles"
l'azote principalement sous forme oxydée.
,
i
Par ailleurs, nous avons mis en évidence que A. albida est une espèce qui se développe mieux:
,
"
,
1
sur des sols riches en éléments nutritifs; cette constatation rejoint l'idée que i'espèce:
.
. :
s'implante préférentiellement sur des sols riches vestiges d'anciennes termitières!
abandonnées.
Nous avons aussi démontré que la croissance initiale de l'espèce est largement
,
.
tributaire des réserves cotylédonaires qui assurent le développement des parties aériennes
etracinaires au cours de 3 à 4 premières semaines de croissance. Les cotylédons agissent
indirectement sur la formation des nodules en stimulant l'activhé fixatrice d'azote; ils


"
1
jouent le rôle d'azote "starter" et en cela justifie la forte proportion de l'azote observée au
niveau des cotylédons d'A. albida par rapport aux Mimosacées sahéliennes.
Les importantes réserves cotylédonaires relèvent de la faculté d'f:)daptation et des
mécanismes de survie mis en place par l'espèce dans un environnement sahélien souvent trés
défavorable.
De même, il est reconnu que chez A. albida, la morphologie du système racin~ire traçant ou
superficiel, constitue un mécanis~e adaptatif qui est fonction de la disponibilité en eau du' sol.
Il apparait de nos observations que le type morphologique racinaire ~ principalement
dépendant du
paramètre eau du sol car quelle que soit la morphologie du système racinaire
le potentiel de fixation pour un génotype donné, est le même. En effet, nos obserVations ont
montré que la morphologie du système racinaire est la résultante phénotypique de,
l'interaction entre le génotype et les conditions de l'environnementracinaire et constitue

156
donc un paramètre peu stable et susceptible de modifications (Gassama,
et al., 1995
soumis).
A l'opposé, le potentiel de fixation est un paramètre génétique à la fois lié au génotype de .Ia
souche et à celui de la plante-hôte. Par conséquent la morphologie du système raciriaire ne
peut pas constituer un' critère de sélection pour l'aptitude à fixer l'azote étant donné
l'indépendance de ces deux caractères qui par ailleurs sont susceptibies de modifications en
fonction des conditions environnementales.
Au .cours de nos expérimentations nous avons montré qu'A. albida est trés peu
spécifique dans le choix de ses associations symbiotiques.
L'absence de spécificité présente des inconvénients majeurs qui sont d'une part le fai~le
potentiel fixateur lié à l'inefficience des nodules formés.
Par ailleurs, ce critère de non spécificité peut être considéré comme un avantage dans la
mesure où quelle que soit la nature de la souche présente dans le sol, on est assuré d'avoir des
plants qui nodulent. Dans ce cas il est possible d'optimiser la quantité d'azote fixée en
sélectionnant les souches les plus effectives. Il apparait aussi que le choix de la souche la
plus efficiente influence non seulement la quantité d'azote fixée par rapport au témoin ri<;>n
inoculé, mais encore à la stratégie d'infection.
En effet, certaines souches offrent une plus grande mobilité ou bien un mécanisme de
reconnaissance bactérie/plante-hôte plus performant que d'autres. Il demeure évident qu'au
moment de la mise en place sur le terrain, le choix d'une souche plus rapidement infective
que les autres souches endémiques du sol, constitue un avantage sélectif trés important pour,
la réussite de l'inoculation.

~.
. .
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157
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